王增四，高文，陈丹，陈菁，黄丹

(1.武汉市中西医结合医院肾病内科，武汉 430022；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院，武汉 430030)

糖尿病肾病是欧美发达国家终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)发生的主要原因，也是我国慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的第二大病因，目前对糖尿病肾病的防治措施包括控制血糖和血压、抑制RAS系统激活，而很大一部分患者最终仍将进入ESRD，因此，研发新的治疗药物显得尤为重要。

内质网是真核细胞中重要的膜性结构细胞器，在脂类物质、蛋白质的合成和运输过程中起核心作用，是调控炎症反应、细胞凋亡的重要病理通路[1-3]。当错误蛋白质或未折叠蛋白质在腔内过度堆积、固醇和脂质代谢失调，导致严重或持久的未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，将影响特定基因表达，如果内质网功能持续激活，最终启动细胞凋亡程序，诱发糖尿病、肿瘤、神经退行性病变等疾病[4-7]。C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)是UPR信号通道共同的下游信号分子，在正常生理状态下低表达，而在内质网应激状态下可大量表达，是内质网应激过程中关键的促凋亡因子[8-10]。系膜细胞过度凋亡是造成糖尿病肾病肾小球系膜细胞缺失、基质增多的重要原因[11-13]。在高浓度葡萄糖的刺激下，系膜细胞内CHOP及其下游信号分子Caspase-3被激活，进而启动系膜细胞凋亡[14]。改善内质网折叠功能的伴侣分子可缓解内质网应激，从而延缓糖尿病肾病进展，这种效应依赖于其对CHOP蛋白活化的抑制，证实了CHOP诱导的系膜细胞凋亡在糖尿病肾病进展中的关键作用[15-17]。衣霉素可通过抑制UDP-N-乙酰氨基葡萄糖在真核细胞内质网的转移，阻断N-连接糖基化，破坏蛋白质的成熟，通过调控CHOP等相关基因表达促进细胞凋亡[18]。本课题组前期研究发现，黄芪的活性成分黄芪甲苷能改善链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠蛋白尿，延缓肾功能恶化，并能抑制衣霉素诱导的足细胞凋亡，上述效应与黄芪甲苷抑制内质网应激的生物学活性有关[19-20]。鉴于对CHOP在内质网应激介导的系膜细胞凋亡作用的认识，结合前期对黄芪甲苷改善大鼠内质网应激缓解糖尿病肾病进展的工作基础，笔者在本研究将观察黄芪甲苷对衣霉素诱导的大鼠肾脏系膜细胞凋亡的影响，并检测内质网应激及凋亡相关标志物的表达水平，旨在探讨黄芪甲苷肾保护作用的潜在分子机制，并为黄芪甲苷在糖尿病肾病的治疗应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验药物 黄芪甲苷(成都锦泰和医药化学技术有限公司，批号：150202，AS-IV，含量≥98%)，4-苯基丁酸(phenylbutyric acid，PBA，美国Sigma公司，批号：SML0309)，衣霉素(美国Sigma公司，批号：654380)。

1.1.2实验试剂 Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒(InvitrogenTM，批号：V13242)，磷酸化eIF2α、磷酸化IREα、GRP78、CHOP、Cleaved-caspase3、Bax和Bcl-2(美国Abcam公司，批号：ab48187，ab21685，ab179823，ab13847，ab182733，ab196495)，磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)(美国CST公司，批号：3179S)，胎牛血清(FBS，美国Gibco公司，批号：1982185)， 碘化丙啶(上海生工生物工程股份有限公司，批号：批号: A601112)。

1.1.3仪器 流式细胞检测仪、MiniPROTEAN 3 型Western 电泳仪、DJ2300 型凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad)，酶标仪(美国ThermoFisher)，低温离心机(美国Beckman)。

1.2系膜细胞培养和干预 大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，参照既往方法进行培养。接种于达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM) 培养基(DMEM +10% FBS)，置于细胞培养箱(33 ℃，饱和湿度，5%CO2) 中培养。以内质网应激诱导剂衣霉素诱导HBZY-1细胞建立内质网应激细胞模型：当细胞长至达70%～80%融合后，用无血清DMEM培养液小心漂洗细胞，改用含2%FBS的DMEM培养基继续培养(用含不同浓度黄芪甲苷或PBA预处理)14 h后，将衣霉素(5 μg·mL-1)小心加入培养基中，继续培养4 h后，细胞模型诱导完成并用于检测。具体干预措施如下：正常对照组予以2%FBS+DMEM培养基；模型对照组加入衣霉素5 μg·mL-1；黄芪甲苷小剂量组加入衣霉素5 μg·mL-1+黄芪甲苷50 μg·mL-1；黄芪甲苷大剂量组加入衣霉素5 μg·mL-1+黄芪甲苷100 μg·mL-1；苯丁酸组加入衣霉素5 μg·mL-1+苯丁酸10 mmol·L-1。

1.3流式细胞技术检测系膜细胞凋亡 取经药物干预后的各组系膜细胞，经0.25% 胰蛋白酶消化后，用磷酸盐缓冲液(PBS )洗涤2 次，调整细胞密度为1×106·L-1，制成单细胞悬液，加入Binding 缓冲液100 μL和FITC 标记的Annexin-V(20 μg·mL-1)10 mL，室温避光30 min，再加入50 μg·mL-1碘化丙啶5 μL，避光反应5 min后，加入Binding 缓冲液400 μL，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测，观察细胞凋亡情况。

1.4蛋白印迹实验 取各组系膜细胞，低温充分匀浆后，加入蛋白裂解液及苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)，冰上放置40 min，4 ℃下12 000 r·min-1(r=10 cm)离心10 min，取上清液提取总蛋白，以BCA方法对上清液进行蛋白定量。取蛋白样品20 μg，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)电泳，100 V转移1 h至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中37 ℃封闭1 h；加入一抗并4 ℃过夜；TBST漂洗后加入二抗室温孵育1 h，TBST漂洗后显色。以β-actin作为内参，以目的蛋白灰度值/内参灰度值反映蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1黄芪甲苷对大鼠系膜细胞凋亡的影响 流式细胞术检测发现，模型对照组经衣霉素干预后，系膜细胞凋亡率较正常对照组明显升高(P<0.05)，给予各浓度黄芪甲苷处理后，细胞凋亡率明显下降，与模型对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而黄芪甲苷大剂量组与苯丁酸组比较，差异无统计学意义，见图1。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.黄芪甲苷小剂量组；D.黄芪甲苷大剂量组；E苯丁酸组；①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05。图1 5组系膜细胞凋亡水平的比较A.normal control group；B.model control group；C.low-dose AS-IV group；D.high-dose AS-IV group；E.phenylbutyric acid group；①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05．Fig.1 Comparison of apoptosis levels of mesangial cells in five groups

2.2黄芪甲苷对系膜细胞内质网应激相关信号通道的影响 与正常对照组比较，模型对照组系膜细胞内质网应激信号分子IRE1α、PERK和eIF2α磷酸化水平明显升高，同时，内质网应激标志蛋白GRP78表达上调，提示细胞内质网应激增强。给予不同浓度黄芪甲苷干预后，IRE1α、PERK和eIF2α磷酸化水平明显下降，GRP78表达下调，这种效应在黄芪甲苷大剂量组较显著，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.黄芪甲苷小剂量组；D.黄芪甲苷大剂量组；E.苯丁酸组；①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05。图2 5组系膜细胞内质网应激信号分子表达水平的比较A.normal control group；B.model control group；C.low-dose AS-IV group；D.high-dose AS-IV group；E.phenylbutyric acid group；①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.Fig.2 Comparison of the expression of endoplasmic reticulum stress signal molecules of mesangial cells in different

2.3黄芪甲苷对衣霉素诱导系膜细胞凋亡信号分子的影响 与正常对照组相比，模型对照组细胞CHOP的表达明显增加，同时，Bax和Cleaved caspase-3的表达显著上调，而Bcl-2表达无明显变化。与模型对照组比较，黄芪甲苷小、大剂量组系膜细胞CHOP表达降低，且Bax和Cleaved caspase-3表达下调。见图3。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.黄芪甲苷小剂量组；D.黄芪甲苷大剂量组；E.苯丁酸组；①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05。图3 5组系膜细胞凋亡相关信号分子表达水平的比较A.normal control group；B.model control group；C.low-dose AS-IV group；D.high-dose AS-IV group；E.phenylbutyric acid group；①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05．Fig.3 Comparison of the expression of apoptosis related signal molecules of mesangial cells in different

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病主要的微血管慢性并发症，其病理改变以肾小球病变为主，早期表现为肾小球系膜细胞增生、系膜基质增加，到中晚期，硬化的肾小球内仍存在过多的系膜基质，但系膜细胞的数量呈耗竭状态，而过度的细胞凋亡是肾小球系膜细胞缺失的重要原因[21-22]。CHOP是内质网应激诱导多种细胞产生凋亡的关键信号分子：过度表达CHOP能下调Bcl-2或使Bax转移至线粒体膜而诱发凋亡[23]；CHOP也可与C/EBPα形成异源二聚体促进Bim蛋白表达而导致凋亡；在高浓度葡萄糖的刺激下，系膜细胞内CHOP及其下游信号分子Caspase-3被激活，从而启动系膜细胞的凋亡，也证实CHOP诱导的系膜细胞凋亡在DN进展中的关键作用[24]。因此，阻断CHOP介导的系膜细胞凋亡，从而逆转内质网应激诱导的糖尿病肾病进展将是治疗的潜在靶点。4-苯基丁酸是一种具有分子伴侣作用的脂肪酸，可通过稳定蛋白质构象、改善内质网折叠蛋白，从而发挥抗内质网应激的生物学效应。进一步的研究发现，4-苯基丁酸可逆转糖尿病肾病、梗阻性肾病等疾病模型引起的肾脏纤维化，这种效应与其阻断内质网应激，抑制CHOP介导的肾脏系膜细胞、小管间质细胞凋亡有关。 本实验也观察到，大鼠系膜细胞在衣霉素干预下内质网应激明显增强，表现为IRE1α和PERK磷酸化水平升高，内质网应激伴侣分子GRP78上调，同时，调控细胞凋亡的CHOP及其下游促凋亡信号的活性明显增高，导致系膜细胞凋亡率明显增加，而给予内质网应激抑制剂4-苯基丁酸干预后系膜细胞内质网应激得到抑制，CHOP及其下游促凋亡信号明显减弱，细胞凋亡率明显下降。

研究表明，黄芪甲苷能抑制NF-κF活性，减少肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、MCP-1和ICAM-1表达，减少Ⅳ型胶原α1链在肾脏中的沉积，从而缓解糖尿病肾病大鼠的肾脏病变[25]。笔者前期的研究发现，黄芪甲苷能改善链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠蛋白尿、缓解肾小球硬化，这种效应与其改善大鼠肾组织内质网应激有关，且这种效应不依赖于其对血糖的影响[19]。本实验进一步证实，黄芪甲苷干预大鼠系膜细胞后，能有效逆转衣霉素诱导的细胞内质网应激，同时，CHOP及下游的Bax和Cleaved caspase3表达下调，从而有效抑制衣霉素诱导的系膜细胞过度凋亡，这种效应与4-苯基丁酸干预组相一致。