温玉发，丁亚军，王虎斌，乔红群

(1.南京工业大学，南京 211816；2.江苏省药物安全性评价中心，南京 211816)

19F-磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)技术被广泛应用于医学各种领域，包括分子成像、细胞示踪、药物递送与定量、氧分压测定、肺功能成像等多方面的精准诊断与治疗研究[1]。传统的氢磁共振(1H-MRI)与19F-MRI相比，由于生物体内含水量>60%，H元素易引发组织内部及不同组织间磁共振影像的相互干扰，而人体中只有牙齿含有少量的氟，19F-MRI 具有无背景噪声干扰且特异性极高的优点。此外，反复使用1H-MRI诊断剂后会残余并积累在人体中的潜在毒性风险也引起了广泛关注[2]。LL02是一个以19F标记的RGD肽类新型造影剂，能与肿瘤血管高水平表达的整合素αvβ3特异性结合，并靶向标记，实现无创的磁共振成像，为肿瘤的成像及同步诊疗开辟了新的途径，进一步推动未来医疗诊断领域的发展[3]。笔者在本研究通过观察药物LL02对清醒状态比格(Beagle)犬心血管和呼吸系统的影响，研究该药物是否存在潜在的对生理功能的不良影响，为临床研究和用药安全提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物 Beagle犬4只，普通级，雌雄各半，成年犬，体质量9.8～11.2 kg(首次给药时)，购自北京玛斯生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0001。饲养于江苏省药物安全评价中心动物房，动物质量合格证号：11400600001621；动物房间温度：18～26 ℃；相对湿度：40%～70%；噪音≤60 dB；换气次数：≥8次·h-1；动物单笼饲养，笼具每月更换1次，更换后喷雾消毒。本研究中动物已通过江苏省药物安全评价中心伦理委员会批准实施，动物伦理编号：IACUC-20180326-01。

1.2药物与试剂 LL02(美国国立卫生研究院，批号：LL20171229-2，含量：97.5%)；溶媒：0.9%氯化钠注射液(江苏淮安双鹤药业有限责任公司，批号：1702033C)。

1.3仪器与设备 DSI植入式生理信号遥测采集系统(包括TA11PA-C10-TOX-LA血压植入子、JET蓝牙接收器、Ponemah Physiology Platform 5.2软件，美国Data Sciences International公司)；电子分析天平(型号：XS105DU，梅特勒-托利多仪器公司，感量：0.01 mg)；双人单面超净台(型号：SW-CJ-2D，苏州净化设备有限公司)；电子台秤(型号：AWH-150TC，上海英展机电企业有限公司)。

1.4给药方案及选择理由 给药剂量：LL02临床使用剂量为40 μg·kg-1。按照《药物安全药理学研究技术指导原则》[4]及相关指导原则要求[5]，分别选择给药剂量为3，6，12 μg·kg-1作为LL02对心血管和呼吸系统影响试验的小、中、大剂量组，剂量相当于人临床等效剂量的2.8，5.5和11.1倍(人平均体质量以60 kg计)；溶媒对照组给予同等体积氯化钠注射液。以上各组动物给药体积均为0.5 mL·kg-1(根据最近一次计划称定质量的动物体质量计算理论给药体积)。给药途径：静脉给药。给药方法：前肢静脉注射，注射器推注。给药频率及期限：单次给药。

1.5分组及给药 采用Double 4×4 拉丁方设计，设溶媒对照组、小剂量组、中剂量组、大剂量组。所有动物实验前已完成植入子植入手术，且术后完全恢复后开始实验。由非临床药动学研究数据表明：LL02在血中的清除迅速。一般给药后2 h，其血液中的放射性降低至初始浓度约5%。在比格犬中血药浓度-时间曲线末端项，清除半衰期(t1/2)为(57.34±11.69) min。而动物的洗脱期往往是消除半衰期5～7倍，所以本文以48 h作为两次给药间隔的洗脱期。

1.6配制溶液 溶媒对照：0.9%氯化钠注射液。LL02：每次于给药前配制足够量给药制剂用于当天的给药。根据体质量，称取适量的LL02，用0.9%氯化钠注射液稀释成浓度为24.0，12.0和6.0 μg·mL-1作为大、中、小剂量组使用。

1.7植入子植入手术 手术前提前打开植入子开关，使其内部电子元件稳定工作，打开软件观察植入子信号及压力是否正常，将压力导管在无菌0.9%氯化钠溶液中浸泡至少15 min。沿股动脉走向切开腹股沟位置皮肤，钝性分离暴露出股动脉1～2 cm。在股动脉的近心端、中间、远心端分别放置一根不可吸收缝线。确保导管内充满生物胶，如导管内产生气泡，使用灌胶注射器将气泡移出。使用导管引导器刺破并扩张血管，将导管缓缓插入动脉腔。确保将导管牢牢得固定到血管上。在腹股沟区域，用不可吸收缝线通过缝合脊将植入子固定在肌肉上。每只比格犬股动脉处已提前植入血压植入子(PA-C10-TOX-LA)，且术后完全恢复后开始实验。心电及体温电极放置位置剃毛，穿戴好马甲内衣，固定好呼吸绑带，预先进行呼吸定标，固定心电或体温电极、血压天线，穿好马甲，所有的线穿过马甲的孔，将电极导线和血压附件连接到JET设备上。使用磁铁打开动物体内植入子开关，AM收音机进行确认。

1.8测量指标

1.8.1体质量 每次给药当天，每只动物称定体质量一次，并记录。

1.8.2血压测定 实验前，打开植入子开关，通过接收器接收信号，记录每只比格犬收缩压(SYS)、舒张压(DIA)及平均动脉压(MAP)的变化。

1.8.3心电指标的测定 通过心电导联记录比格犬标准Ⅱ导联心电图，观察心率(HR)、心电图(QRS、PR、QT、QTcB)变化情况。校正QT间期采用Bazett公式计算，QTcB=QT/(RR)1/2。

1.8.4呼吸指标测定 实验前固定每只比格犬的胸部绑带和腹部绑带，通过呼吸传感器和呼吸流量测定模块对每只动物进行呼吸定标，实验时通过呼吸绑带记录每只动物潮气量及呼吸频率的变化。

1.8.5指标数据采集与分析 使用DSI Ponemah Physiology Platform 5.2软件对以上指标进行自动采集，连续记录给药前2 h至给药后2 h的数据。分别对给药前1 h及给药后(按给药结束时间点计)5，10，15，30，60，90，120 min各个检测点的数据进行分析。人工核对心电图波形标记是否正确。计算各指标每个时间点处1 min内的平均值。当动物身体活动导致1 min内中有不稳定信号时，选择该时间点附近最接近该时间点的连续1 min时间段的数据进行分析，并将分析结果作为相应时间点的检测结果。

2 结果

2.1心电图 监测小、中、大剂量组给药前、给药后5，10，15，30，60，90，120 min各时间点心电指标(心率、QRS、PR、QT、QTcB)，分组因素和时间因素无交互作用。与溶媒对照组对应时间点比较，各给药组各项心电指标均差异无统计学意义(均P>0.05)。结果见图1。

图1 LL02对比格犬心率和QRS、PR、QT间期及QTcB的影响Fig.1 Effects of LL02 on heart rate， QRS interval， PR interval， QT interval and QTCB of Beagle

2.2血压 LL02小、中、大剂量组不同时间点收缩压、舒张压、平均动脉压，分组因素和时间因素无交互作用。与溶媒对照组对应时间点比较，各给药组收缩压、舒张压、平均动脉压均差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 LL02对比格犬收缩压、舒张压和平均动脉压的影响Fig.2 Effects of LL02 on systolic， diastolic and mean arterial pressure of Beagle

2.3呼吸 LL02小、中、大剂量组不同时间点潮气量、呼吸频率，分组因素和时间因素无交互作用。与溶媒对照组对应时间点比较，各给药组潮气量、呼吸频率均差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 LL02对比格犬潮气量和呼吸频率的影响Fig.3 Effects of LL02 on tidal volume and respiratory rate of Beagle

3 讨论

安全药理学是研究药物剂量在治疗范围内及超过治疗范围时，潜在不期望出现的生理机能的药物作用，主要考察其对动物心血管系统、呼吸系统和中枢神经系统潜在的影响。根据需要对药物进行追加和(或)补充的安全性药理研究[7]，弥补毒理实验观察的不足，为临床试验所需的药理及毒理信息提供了参考。

ICH S7A[8]、S7B[9]和《药物安全药理学研究技术指导原则》在进行心血管系统、呼吸系统的安全性评价时，均推荐使用清醒动物模型。与传统麻醉动物的方式比较，使用清醒动物可提高QT间期、心率和血压等安全药理学参数的灵敏度和准确性;能更好地模拟正常动物给药后在不受束缚情况下的反应。另外经过药物洗脱期后动物可重复给药，符合动物实验减少、优化、替代的3R原则[10-11]。

LL02作为一种新型高分辨率、高灵敏度MRI探针造影剂，利用F原子磁共振效应，可直接或间接显示生物体内更为丰富的结构信息，在活体内无背景信号干扰且不会残留体内，其精湛的空间分辨能力使其具有更为准确的定位能力，更加有利于病理生理学的评估[12]。

本研究通过对预先埋植有DSI遥测植入子的清醒Beagle犬静脉注射3，6，12 μg·kg-1的LL02，发现Beagle犬心电图(心率、QRS间期、PR间期、QT间期、QTcB)和血压(收缩压、舒张压、平均动脉压)及呼吸(潮气量、呼吸频率)指标均未见明显改变，并未发现有1H-MRI造影剂在使用中的毒性反应，说明在上述剂量下的新型19F-MRI造影剂LL02安全性良好，在较大剂量应用于磁共振诊疗肿瘤时也较为安全，具有很好的临床应用前景。