刘倩 杨菁

哺乳动物的妊娠是一个独特、动态的免疫过程。妊娠期母体能忍受异体胎儿在体内的生长，免疫耐受异常则可导致自然流产的发生，但母胎免疫调控的机制目前仍不明确。Fyn为非受体酪氨酸激酶SRC家族中的一员，参与调控各类免疫活动，尤其是T淋巴细胞的发育和功能，与多种自身免疫性疾病和移植排斥相关[1, 2]。虽然Fyn对辅助性T细胞(T helper cells, Th cells)Th1和Th2的发育无明显影响，但可能通过干扰素调节因子4(interferon regulatory factor 4, IRF4)调控Th17细胞的增殖分化[3]。Th17细胞作为母胎免疫中的关键性元素，与自然流产的发病密切相关。我们的前期研究发现，IRF4可通过视黄酸相关的孤儿受体γt(RAR-related orphan receptor Gamma T, RORγt)调控Th17细胞的分化和功能，进而影响母胎免疫[4]。但是，Fyn在母胎界面的表达及作用仍然未知。因此，本研究拟探讨Fyn在母胎界面的表达特点及其对Th17细胞和相关炎症因子的调控作用，为进一步阐明流产发生的原因和母胎耐受的调控机制，以及寻找新的防治手段提供创新性的理论依据。

材料与方法

一、材料

1. 实验动物：雌性和雄性BALB/C小鼠，SPF级，8～10周，购于武汉大学动物中心(动物合格证号：SCXK(鄂)2008-0004)。雌性CBA、雄性DBA/2小鼠，SPF级，8～10周，购于南京大学生物医药研究所(动物合格证号：SCXK(苏)2010-0001)。相关动物操作已通过武汉大学伦理学委员会批准。

2. 主要试剂：RNA抽提试剂Trizol(美国invitrogen公司)、RNA逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR检测试剂盒(日本takara公司)、Fyn多克隆抗体和GAPDH单克隆抗体(美国CST公司)、鼠通用型免疫组化试剂盒(丹麦Dako Denmark A/S公司)、小鼠Fyn单克隆抗体(美国Santa Cruz生物公司)、IRDye 800CW标记的羊抗兔IgG(美国LI-COR Biosciences公司)、流式检测试剂盒(美国eBioscience公司)、Fyn活性抑制剂SU6656和细菌脂多糖LPS(美国sigma公司)。

3. 孕鼠模型建立：同种正常妊娠模型(BALB/C雌雄鼠合笼)；自然流产模型(CBA雌鼠×DBA/2雄鼠)，同时以正常妊娠模型(C57BL/6 ×BALB/c)为对照。检出阴栓的当天记为妊娠的第0.5天(E0.5天)。

二、方法

1. LPS诱导流产模型及各实验组的处理：将正常妊娠小鼠随机分为4组行腹腔注射，前3组在E7.5天予以LPS 2.5mg：①低剂量SU6656 组，E 6.5、7.5、8.5天注射SU6656 5μg；②高剂量SU6656 组，E6.5、7.5、8.5天给予SU6656 20μg；③LPS组，E6.5、7.5、8.5天注射SU6656 对应的溶剂；④对照组，在E6.5、7.5和8.5天仅给予等量的相应溶剂。

2. 标本的采集和处理：对于同种正常妊娠模型，在E4.5、E8.5、E12.5、E16.5天，将小鼠断颈处死，取子宫/胎盘组织，行实时定量PCR(real time quantitative PCR, qPCR)检测；对于自然流产和对照的正常妊娠模型小鼠，在E14.5天，获取胎盘组织置于4%多聚甲醛中固定或低温冻存。对于LPS诱导流产模型及各实验组，在E10.5天，计算胚胎吸收率(被吸收的胚胎总数/着床胚胎的总数)；收集子宫胎盘复合组织, 分离提取单核细胞或冻存待检测。

3. qPCR检测子宫、胎盘中Fyn、RORγt mRNA表达：将组织在液氮中进行研磨，以Trizol法抽提总RNA。按照试剂盒说明合成cDNA，并进行PCR反应。小鼠Fyn、RORγt及内参β-actin引物均由日本Takara公司设计合成(表1)。

表1 引物序列表

4. 免疫组织化学染色检测胎盘中Fyn的定位表达：固定的胎盘组织行石蜡包埋、切片，常规脱蜡，抗原修复。封闭后一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗4℃孵育50min。二氨基联苯胺(DAB)显色、复染、脱水干燥、透明后封片。显微镜下棕黄色部分为阳性表达。

5. Western blot检测胎盘中Fyn蛋白表达水平：组织裂解后提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。采用10%SDS-PAGE分离蛋白质，并转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1h，一抗孵育4 ℃过夜。漂洗后，荧光二抗室温封闭1h。置于Odyssey Classic近红外双色激光成像系统中扫描并分析。

6. 流式细胞学检测母胎界面Th17细胞和Treg细胞：将子宫胎盘复合组织置于200目尼龙网上研磨，收集过滤后的组织溶液，采用Ficoll细胞分离液分离提取单核细胞。加入PRMI 1640培养液重悬细胞并分装，加入不同荧光标记的抗体进行膜表面标记，破膜，加入CD16/32抗体阻断非特异染色，选择性加入PE标记的IL-17A/FOXP3抗体，离心、重悬细胞后置于FACS Calibur流式细胞仪(美国BD生物科学公司)中检测。

7.统计学分析

结 果

一、Fyn在妊娠小鼠不同阶段母胎界面的表达研究

qPCR结果显示子宫胎盘组织中Fyn mRNA的含量在妊娠过程中呈动态变化，E4.5天最高，着床后则明显下降至非妊娠期水平以下，妊娠中期最低，妊娠晚期略有回升。此外，妊娠过程中Fyn与RORγt mRNA的表达呈正相关(图1)。

图1 Fyn在小鼠妊娠不同阶段的表达特点

二、Fyn在自然流产和正常妊娠小鼠母胎界面中的表达差异

根据子宫胎盘复合组织的结构特点，将其可分为子宫系膜淋巴聚集区、蜕膜区、交界区和迷路区。免疫组化结果显示，Fyn的表达在两组中均主要见于系膜淋巴聚集区的淋巴细胞，同时偶见于迷路区的滋养细胞。并且，自然流产组可见更多的淋巴细胞浸润与Fyn阳性表达(图2)。定量研究显示，与正常妊娠组相比，Fyn mRNA和蛋白水平在自然流产组均有不同程度的升高。其中，qPCR结果显示自然流产组Fyn mRNA水平明显高于正常妊娠组，差异具有统计学意义(图3)。

图2 Fyn在小鼠母胎界面的免疫组织化学染色结果

图3 Fyn在自然流产和正常妊娠小鼠母胎界面的表达差异

三、Fyn在LPS诱导的小鼠流产模型中的作用研究

1. 各组小鼠胚胎吸收率的统计差异：腹腔注射LPS成功构建了同种异系小鼠流产模型，LPS处理组的流产率高达65.2%。20 μg SU6656可有效逆转LPS引起的胚胎吸收，使胚胎吸收率下降至 22.7%，尽管该值仍然高于未使用药物处理的对照组(6.6%)。而5μg SU6656组的胚胎吸收率仍高达71.4%，与LPS处理组比较差异无统计学意义，且明显高于20 μg SU6656组和对照组。

2. 各组妊娠小鼠母胎界面IL-17、RORγt、TNF-α和IFN-γ mRNA表达差异：LPS组中IL-17、RORγt和TNF-α mRNA水平均明显高于20 μg SU6656组。LPS组IFN-γ mRNA表达水平虽有轻微上升，但与其余组比较差异无统计学意义(图4)。

图4 各组妊娠小鼠母胎界面IL-17、RORγt、TNF-α和IFN-γ mRNA表达差异

3. 各组妊娠小鼠母胎界面Th17/Treg 细胞免疫模式比较：正常妊娠小鼠母胎界面上Th17细胞含量较低，使用LPS处理小鼠后明显升高；SU6656则可抑制LPS引起的Th17细胞比例的增加，使其下降至接近正常水平。Treg细胞比例在三组间差异均无统计学意义。Th17/Treg细胞的比值则同样于LPS处理后大幅升高，加入SU6656后明显下降，但是仍高于对照组(图5)。

图5 各组妊娠小鼠母胎界面Th17/Treg细胞免疫模式

讨 论

哺乳动物妊娠过程中，母体呈现出特殊的免疫状态，一方面要忍受异体的胎儿在体内的生长，另一方面要抵抗可能危害到母体自身或胎儿的感染。免疫激活和耐受间任何一点微小的失衡均可能危及胎儿的生存。胎儿因携带父源性的白细胞组织相容性抗原(human leukocyte antigen, HLA)而具有半抗原性，其如何逃避母体的免疫排斥目前仍不完全清楚[5]。胎儿所携带的同种异体抗原可被母体的抗原呈递细胞识别并呈递给特定的CD4+T细胞。CD4+T细胞受到抗原刺激后可分化为Th1、Th2、Th17和Treg细胞。Th17细胞可选择性地分泌IL-17，在诱导炎症反应和免疫排斥中具有重要作用，参与母胎界面局部的免疫调控，并可能介导流产的发生[6]。

Fyn可调节细胞的生长、存活、粘附活动等[7, 8]，在多项生理过程中发挥重要作用，并参与多项生殖活动，包括卵子的发育和成熟[9]、精子发生和顶体反应[10]等。值得注意的是，Fyn几乎参与了T淋巴细胞发育和功能分化的所有阶段。但是，目前Fyn对Th细胞的作用仍所知甚少。虽然其可能对Th1和Th2细胞无明显作用，却可影响Th17细胞的分化和功能[11]。我们的研究发现，母胎界面Fyn的表达与Th17细胞的分化有关。在妊娠的大部分阶段，Fyn处于低表达水平，与Th17细胞的抑制状态一致。低水平的Fyn有利于抑制Th17细胞的分化和功能，维持妊娠免疫耐受。妊娠4.5天，Fyn的表达达到高峰，说明高水平的Fyn可能有利于胚胎着床。Fyn与RORγt表达水平呈正相关，进一步提示Fyn可能调控RORγt的表达促进Th17细胞的分化。

妊娠过程中免疫失衡可导致自然流产的发生。大量研究证据表明，Th17细胞数量和功能的失衡是流产发生的重要因素[6, 12]。Qian[13]等人的研究即发现，Th17细胞在原因不明性复发性流产患者母胎界面的数量明显高于正常妊娠者。我们对小鼠模型的研究结果显示Fyn的mRNA和蛋白表达水平在自然流产模型小鼠母胎界面高于正常妊娠模型小鼠，这可能也与Fyn在Th17细胞分化和功能中的作用有关。

为了进一步研究Fyn在母胎免疫中的作用，我们对LPS诱导的流产模型小鼠进行了Fyn活性抑制剂干预实验。LPS诱导下的小鼠流产模型被认为是一种可用于研究炎症、免疫状态与自然流产的有效动物模型。在本研究中，仅在妊娠的第7.5天腹腔注射一次2.5 μg的LPS即可引起小鼠大范围流产，胚胎吸收率高达65.2%。Fyn与LPS存在多方面的功能共同点。Panicker等人的研究发现，LPS刺激下，Fyn迅速活化，继而参与促炎性信号传导通路的调控[14]。本部分实验结果显示Fyn同样在LPS介导的小鼠流产中发挥关键作用，一旦Fyn的活性被充分抑制，LPS则不能有效诱发小鼠流产。此外，充分抑制Fyn的活性可同时下调LPS引发的小鼠母胎界面IL-17和RORγt的异常高表达。IL-17和RORγt的表达变化提示Th17细胞功能和增殖分化水平的改变，被认为与流产的发生有关[15,16]。同时，流式细胞学检测结果直接显示，Th17细胞的占比和Th17/Treg细胞比值在LPS作用下大幅升高，经SU6656处理后则可下降至接近正常状态。因此，抑制Fyn的活性可通过对母胎界面Th17细胞的调控防止自然流产的发生。

Treg细胞是CD4+T细胞中的另一亚型，与Th17细胞具有相反的功能，可抑制炎症因子的分泌，进而防止母体对胚胎/胎儿的免疫排斥，Th17/Treg细胞间的平衡模式对母胎免疫耐受和流产的发生十分重要。但是，本研究中，LPS的作用并未导致Treg细胞数量的异常变化，可能是通过其他信号通路得到了代偿性的维持。此外，有研究指出，Treg细胞主要在胚胎着床和早期妊娠阶段发挥重要作用，对于后期妊娠的维持并不是必需的[17]。

与既往研究一致，我们在LPS诱导的流产小鼠的母胎界面上检测到一系列细胞因子的异常表达，除IL-17和RORγt外，还包括TNF-α和IFN-γ。TNF-α和IFN-γ作为与妊娠相关的促炎性细胞因子，参与诱导流产的发生[18,19]。我们的研究发现SU6656可抑制LPS诱发的TNF-α表达升高；在不同实验组间虽未检测到IFN-γ表达水平的统计学差异，但是LPS组IFN-γ表达水平有升高趋势，SU6656处理组IFN-γ表达水平甚至低于正常组，所以仍然不能排除LPS和SU6656对IFN-γ表达的调控作用。总之，SU6656抑制LPS引发的TNF-α和IFN-γ的异常高表达，提示Fyn参与了两者的表达调控。TNF-α和IFN-γ的表达还可体现多种免疫细胞的状态，包括巨噬细胞、自然杀伤细胞和Th1细胞等。既往报道指出，Fyn同样可调控巨噬细胞、自然杀伤细胞、Th2细胞等的分布和分化[2,19,20]。因此，Fyn不仅通过Th17细胞参与自然流产的发生，巨噬细胞、自然杀伤细胞和Th1细胞等也可能直接或间接参与其中。

综上所述，本研究首次在母胎界面检测到了Fyn的表达，并发现其主要通过影响Th17细胞的增殖分化和功能，参与母胎免疫调控和自然流产的发生，具体机制及Fyn对母胎界面其他免疫细胞的影响尚需进一步研究。