顿彩虹， 白爱红， 谢文燕， 戚静宜

（1.漯河市妇幼保健院生殖遗传科，河南漯河 462000；2.洛阳市中心医院生殖医学科，河南洛阳 471699）

卵巢储备功能是指卵巢皮质区域卵泡生长、发育、形成可受精卵泡的功能，反映女性生育潜能及生殖内分泌功能[1]。若卵巢储备功能下降，将减少卵巢内储存的可募集卵泡数目，导致卵巢形成卵子的能力减弱、卵泡质量下降，影响女性的生育能力，表现为闭经、月经稀发、不孕甚至卵巢早衰等[2-3]。中医在调节女性生殖功能失调性疾病方面具有独到之处，对卵巢储备功能减退主要从肝肾辨证论治入手，同时兼顾痰湿、气血等，可促进性腺轴恢复正常，增强卵巢功能，防止出现病理性改变，平衡性激素分泌[4]。菟丝子为旋花科植物菟丝Cuscuta chinensisLam.的种子，味辛、甘，性微温，入肝、肾经，具有补肾益精、养肝明目、安胎的功效。菟丝子为温阳补肾之要药，可改善机体内分泌，增强性功能，具有抗氧化、调节免疫等作用[5]。菟丝子总黄酮为菟丝子的主要成分，现代药理研究表明，其可改善大鼠生殖内分泌系统损伤[6]，对下丘脑-垂体-性腺轴有多方面作用，可恢复下丘脑-垂体促性腺功能，增加垂体、卵巢对激素的反应性，促进卵泡发育，提高卵巢激素受体数量与功能，有类雌激素样活性[7-8]。本研究构建卵巢储备功能减退大鼠模型，旨在探讨菟丝子总黄酮改善卵巢储备功能的作用及其可能机制，以期为临床应用菟丝子总黄酮改善卵巢储备功能提供实验基础，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级健康雌性SD大鼠68只，21日龄，体质量（50±2）g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。实验单位为河南中医药大学动物实验中心。实验开展前适应性饲养1周，自由摄食水，自然光照。

1.2 药物、试剂与仪器菟丝子总黄酮（纯度＞98%，购自上海谱振生物科技有限公司，批号：20191204）。去氧乙烯基环己烯（4-cinylcyclohexene diepoxide，VCD）、环磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）信号通路抑制剂H-89（纯度＞99%，碧云天生物技术有限公司）；促卵泡激素（FSH）、促黄体激素（LH）、雌二醇（E2）、cAMP酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海士锋生物科技有限公司）；兔抗大鼠卵泡刺激素受体（FSHR）、PKA、磷酸化PKA（p-PKA）、β-actin单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）抗体（艾美捷科技有限公司）。电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；-80℃超低温冰箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；恒温冰冻切片机、EG1150组织包埋机（德国Leica公司）；全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（美国Media Cybernetics公司）。

1.3 分组与造模68只21日龄的雌性大鼠适应性饲养1周后达28日龄，阴门开启，经阴道脱落细胞涂片筛查，性周期正常。抽取10只大鼠设为正常组，其余构建卵巢储备功能减退模型[9]，方法：取VCD溶入芝麻油，配制浓度为80 mg/kg，每天1次，连续腹腔注射15 d，0.2 mL/只。正常组腹腔注射等体积芝麻油，每天1次。造模期间每日上午7∶00—8∶00进行阴道涂片，阴道上皮无动情周期变化，或动情周期明显延长，则提示卵巢储备功能减退大鼠造模成功[10]。造模成功大鼠48只，成功率为82.76%，随机分为抑制剂组、模型组、抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组，每组12只。

1.4 干预方法造模成功后次日给药：抑制剂组灌胃H-89 0.1 mg/kg[11]，菟丝子总黄酮组灌胃菟丝子总黄酮530.1 mg/kg[12]，抑制剂+菟丝子总黄酮组先灌胃菟丝子总黄酮530.1mg/kg再灌胃H-890.1mg/kg，模型组、正常组灌胃等体积生理盐水，均连续4周，每周休息1 d。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 取材 给药结束后，用戊巴比妥钠麻醉大鼠，经腹主动脉取血5 mL。处死大鼠，分离两侧卵巢组织，称质量。继而将卵巢组织处理如下：一份液氮冷冻；一份以40 g/L多聚甲醛固定24 h，冲洗后滤纸吸干多余水分，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，制作蜡块保存。

1.5.2 观察大鼠一般状况及测定卵巢湿质量、卵巢指数 观察大鼠一般状况，包括形态、活动、毛色、体质量等，称两侧卵巢湿质量，计算卵巢指数，公式：左侧（右侧）卵巢指数=左侧（右侧）卵巢湿质量（mg）/大鼠体质量（g）。

1.5.3 ELISA法检测血清性激素水平 取大鼠腹主动脉血液标本，取血后快速置入促凝管内，室温静置1 h，3 000 r/min离心（离心半径10 cm）10 min，取血清待用。按照ELISA试剂盒说明书检测血清FSH、LH、E2水平，并计算FSH/LH。应用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值，计算各指标浓度。

1.5.4 苏木素-伊红（HE）染色法观察卵巢组织形态学变化 取卵巢组织蜡块，制作5μm切片，展片；干净玻片捞片，烘干；二甲苯脱蜡，梯度酒精水洗，常规苏木素染色10 min；水洗，1%盐酸酒精分色20 s，1%氨水溶液返蓝；自来水冲洗15 min，1%伊红水溶液复染5 min；水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察卵巢形态学变化。

1.5.5 ELISA法检测卵巢组织中cAMP含量 取液氮冷冻的卵巢组织，匀浆，以3 000 r/min（离心半径10 cm）离心10 min，取上清。用96孔板，每孔加入50μL抗体，加入10μL标准品，室温孵育2 h，洗板，显色，终止，读板，450 nm波长上机检测，570 nm波长校正。二喹啉甲酸（BCA）法检测组织总蛋白浓度，计算各组大鼠卵巢组织中cAMP含量，公式：cAMP含量=ELISA检测浓度值/各样本BCA结果。

1.5.6 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测卵巢组织FSH-cAMP信号轴相关蛋白FSHR、PKA、

p-PKA表达 取液氮冷冻的卵巢组织在冰盒中研磨，匀浆后置入低温离心机，以4℃、20 000 r/min（离心半径10 cm）离心20 min，取上清。BCA法检测蛋白浓度，根据蛋白浓度，按上样量40μg计算样本稀释浓度，沸水浴10 min变性，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后湿法转膜。将硝酸纤维素膜置入50 g/L脱脂奶粉中封闭2 h；再取出置入一抗稀释液[兔抗大鼠FSHR、PKA、p-PKA、β-actin（内参）单克隆抗体，稀释比例分别为1∶500、1∶1 000、1∶2 500]中孵育过夜；TBST洗膜后，再置入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000稀释）中，室温下孵育1 h；TBST洗膜，电化学发光试剂（ECL）显色。经成像系统采集硝酸纤维素膜上的蛋白信号，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算目的条带灰度值。结果以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值表示。

1.6 统计方法采用SPSS 25.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，并进行正态分布检验与Levene检验。符合正态分布且方差齐者，用单因素方差分析、LSD-t比较，方差不齐者用Welch检验、Dunnett’s T3比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状况比较实验过程中正常组大鼠饮食、活动、二便等情况均正常，皮毛整洁、有光泽，体质量渐增，动情周期规律；模型组大鼠进食、二便次数减少，大便稀，毛色枯燥，有脱毛，体质量渐降，动情周期延长、紊乱，镜下见上皮细胞增多，多于动情间期；抑制剂组大鼠异常表现较模型组严重，抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组则相对轻微。

2.2 各组大鼠卵巢湿质量与卵巢指数比较表1

表1 各组大鼠卵巢湿质量与卵巢指数比较Table 1 Comparison of ovarian wet mass and ovarian index of rats in various groups （±s）

表1 各组大鼠卵巢湿质量与卵巢指数比较Table 1 Comparison of ovarian wet mass and ovarian index of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与抑制剂组比较；③P＜0.05，与模型组比较；④P＜0.05，与抑制剂+菟丝子总黄酮组比较

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结果显示：各组大鼠卵巢湿质量、卵巢指数组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，抑制剂组、模型组、抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组的左侧和右侧卵巢湿质量及卵巢指数均降低（P＜0.05）。与抑制剂组比较，模型组、抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组的左侧和右侧卵巢湿质量及卵巢指数均升高（P＜0.05）；与模型组比较，抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组的左侧和右侧卵巢湿质量及卵巢指数均升高（P＜0.05）；与抑制剂+菟丝子总黄酮组比较，菟丝子总黄酮组的左侧和右侧卵巢湿质量及卵巢指数均升高（P＜0.05）。

2.3 各组大鼠性激素水平比较表2结果显示：各组大鼠FSH、FSH/LH、E2水平组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），LH水平组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常组比较，抑制剂组、模型组、抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组的FSH、FSH/LH、E2水平升高（P＜0.05）。与抑制剂组比较，模型组、抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组的FSH、FSH/LH、E2水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组的FSH、FSH/LH、E2水平降低（P＜0.05）；与抑制剂+菟丝子总黄酮组比较，菟丝子总黄酮组的FSH、FSH/LH、E2水平降低（P＜0.05）。

表2 各组大鼠性激素水平比较Table 2 Comparison of sex hormone levels of rats in various groups （±s）

表2 各组大鼠性激素水平比较Table 2 Comparison of sex hormone levels of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与抑制剂组比较；③P＜0.05，与模型组比较；④P＜0.05，与抑制剂+菟丝子总黄酮组比较

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2.4 各组大鼠卵巢组织形态变化比较图1结果显示：正常组卵巢体积较大，卵泡生长活跃，黄体发育良好；模型组卵巢萎缩明显，卵泡数量减少，黄体减少；与模型组比较，抑制剂组卵巢萎缩更明显，卵泡与黄体数量更少，而抑制剂组+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组卵巢、卵泡与黄体数量明显改善。

图1 各组大鼠卵巢组织形态变化比较（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of histomorphological changes of ovarian tissue of rats in various groups（by HE staining，×100）

2.5 各组大鼠卵巢组织中cAMP含量比较表3结果显示：各组大鼠卵巢组织中cAMP含量组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，抑制剂组、模型组、抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组卵巢组织中cAMP含量降低（P＜0.05）。与抑制剂组比较，模型组、抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组的cAMP含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组cAMP含量升高（P＜0.05）；与抑制剂+菟丝子总黄酮组比较，菟丝子总黄酮组cAMP含量升高（P＜0.05）。

表3 各组大鼠卵巢组织中cAMP含量比较Table 3 Comparison of content of c AMP in ovarian tissue of rats in various groups（±s，pmol·mg-1）

表3 各组大鼠卵巢组织中cAMP含量比较Table 3 Comparison of content of c AMP in ovarian tissue of rats in various groups（±s，pmol·mg-1）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与抑制剂组比较；③P＜0.05，与模型组比较；④P＜0.05，与抑制剂+菟丝子总黄酮组比较

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2.6 各组大鼠卵巢组织中FSH-cAMP信号通路相关蛋白表达比较表4、图2结果显示：各组大鼠FSHR、p-PKA蛋白相对表达量组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），PKA蛋白相对表达量组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常组比较，抑制剂组、模型组、抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组的FSHR、p-PKA蛋白相对表达量降低（P＜0.05）。与抑制剂组比较，模型组、抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组的FSHR、p-PKA蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与模型组比较，抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组的FSHR、p-PKA蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与抑制剂+菟丝子总黄酮组比较，菟丝子总黄酮组的FSHR、p-PKA蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。

图2 大鼠卵巢组织中FSHR、PKA、p-PKA蛋白Western Blot电泳条带图Figure 2 Western Blot bands of FSHR，PKA and p-PKA proteins in ovarian tissue of rats

表4 各组大鼠卵巢组织中FSHR、PKA、p-PKA蛋白相对表达量比较Table 4 Comparison of protein relative expression of FSHR，PKA and p-PKA in ovarian tissue of rats in various groups （±s）

表4 各组大鼠卵巢组织中FSHR、PKA、p-PKA蛋白相对表达量比较Table 4 Comparison of protein relative expression of FSHR，PKA and p-PKA in ovarian tissue of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与抑制剂组比较；③P＜0.05，与模型组比较；④P＜0.05，与抑制剂+菟丝子总黄酮组比较

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3 讨论

卵巢作为女性生殖器官，负责卵子的产生与排出，分泌的激素对女性的经、带、胎、产过程具有调节作用。随着女性年龄的增长，卵巢功能日渐衰退，致卵巢储备功能减退，影响受孕能力，甚或伴发闭经并至全身其他系统疾病。卵巢储备功能减退涉及遗传、医源性、环境等影响因素，发病机制目前尚不完全清楚[13]。本研究通过腹腔注射VCD构建卵巢储备功能减退实验动物模型，高度模拟了女性卵巢储备功能减退状态。可见造模后的大鼠形态、活动、毛色、动情周期等出现异常变化，卵巢湿质量减轻，卵巢指数下降，而经菟丝子总黄酮治疗后则明显改善，提示菟丝子总黄酮可恢复卵巢储备功能减退大鼠动情周期，增加卵巢质量，纠正降低的卵巢指数，改善卵巢储备功能。本研究经HE染色观察大鼠卵巢组织形态学与卵泡情况后发现，模型组卵巢明显萎缩，卵泡数量减少，闭锁卵泡增多，而菟丝子总黄酮组卵巢体积增大，皮质内可见大量生长卵泡，较多接近成熟卵泡，提示菟丝子总黄酮可促进卵巢储备功能减退大鼠卵巢各级卵泡发育。

血清性激素是反映卵巢储备功能的指标。FSH是腺垂体促性腺激素细胞合成、分泌的糖蛋白类促性腺激素，其分泌可影响卵巢内卵泡的发育、排卵[14]。LH通过与卵巢膜细胞LH受体结合，刺激卵泡膜细胞分泌雄激素，从而为雌激素的产生提供原料。卵巢储备功能减退初期，FSH、LH均上升，前者早于后者，且更显著，FSH/LH比值升高则可预判卵巢储备功能减退。E2由卵巢膜细胞、颗粒细胞分泌，在FSH和LH作用下合成，是评价卵巢储备功能的常用指标[15]。膜细胞合成的雄激素进入颗粒细胞，在芳香化酶P450作用下转化为雌激素。长期高E2、FSH/LH水平不利于优势卵泡发育，因而恢复FSH、E2、LH水平对卵巢早衰的治疗十分重要。本研究结果显示，与模型组比较，菟丝子总黄酮组的FSH、E2、FSH/LH比值下降，提示菟丝子总黄酮具备调节血清性激素功能的作用，体现了其类雌激素样作用。

卵泡是卵巢局部与循环雌激素的主要来源，雌激素水平受FSH调控，FSH调节卵巢颗粒细胞膜中芳香化酶基因表达，并触发cAMP依赖的信号级联调节芳香化酶基因转录，诱导雌激素生物合成。FSH-cAMP/PKA信号转导通路是经典的调节卵巢功能的通路之一，FSH与颗粒细胞上分布的FSHR特异性结合，通过细胞膜上G蛋白受体激活cAMP，增加细胞中cAMP浓度，打破cAMP平衡[16]。据报道[17]，cAMP在卵巢发育过程中可调控卵母细胞成熟与卵泡发育。高浓度的cAMP激活细胞内PKA，活化（磷酸化）的PKA转录激活目的基因，促使特异性蛋白合成并分泌至卵巢内，促进卵泡的发育。本研究结果显示：从抑制剂组到模型组、抑制剂+菟丝子总黄酮组、菟丝子总黄酮组，卵巢组织中FSHR、p-PKA蛋白表达水平及cAMP含量逐渐升高，提示菟丝子总黄酮可能通过调节FSH，激活cAMP/PKA信号转导通路，增加卵巢局部cAMP含量，促进卵泡发育，从而改善卵巢的储备功能。

综上所述，菟丝子总黄酮可能通过激活FSHcAMP/PKA信号转导通路，发挥对卵巢储备功能减退大鼠卵巢储备功能的保护作用。