苏清君，李鹏，边朝辉，宋广明，马文明

北京中医药大学房山医院骨伤科，北京102400

骨折延迟愈合是骨折手术后常见并发症，可导致患者严重残疾、生活质量下降和医疗负担加重。评估与骨折延迟愈合相关指标有助于预测骨折延迟愈合风险，为临床制定治疗策略提供依据。研究显示，细胞因子、趋化因子、生长因子以及微小核糖核酸(miRNA)等参与了骨折愈合过程，其表达异常与骨折延迟愈合密切相关[1]。miR-133a具有调节骨代谢的作用，可通过成纤维细胞生长因子受体1-丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶信号通路诱导糖皮质激素诱导的骨量丢失[2]。骨形态发生蛋白2(BMP-2)是一种强有力的骨诱导生长因子，可募集成骨细胞，促使成骨细胞分化，促进骨形成[3]。鉴于此，本研究拟探讨miR-133a、BMP-2与股骨颈骨折延迟愈合的关系，以期为临床诊断和治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料来源 选择2019年2月—2021年6月在我院接受手术治疗的251例股骨颈骨折患者，纳入标准：①X线、CT检查提示单侧股骨颈骨折；②住院接受内固定手术治疗；③知情同意本研究，签署同意书。排除标准：①既往骨折病史或骨科手术史；②退行性关节炎、滑囊炎、滑膜炎、股骨头坏死、类风湿关节炎、骨肿瘤；③急慢性感染、免疫和血液系统疾病。根据术后是否发生骨折延迟愈合(诊断标准：骨折后≥3个月X线检查显示无或极少骨痂生成，断端骨质可见硬化、间隙)，将患者分为延迟组(n=30)和正常组(n=221)。两组临床资料比较见表1，延迟组开放性骨折、骨质疏松、糖尿病、目前吸烟、局部感染、筋膜室综合征所占比例均高于正常组(P<0.05或<0.01)。本研究获得我院伦理委员会审核批准。

表1 两组临床资料比较[例(%)]

1.2 血清miR-133a、BMP检测 于术后4周复查时，采集患者外周静脉血3 mL，4 ℃ 3 000 r/min离心15 min(离心半径10 cm)，取上清液，-80 ℃保存。血清miR-133a检测采用RT-PCR法。取血清样本，使用miRNA分离试剂盒(PureLinkTM，美国赛默飞公司)提取miRNA，使用含miR-133a和U6的茎环RT引物的逆转录酶(SuperScriptTMⅡ，美国赛默飞公司)逆转录合成cDNA。PCR引物由上海基康公司完成，引物序列：miR-133a上游引物5′-GCGTTTGGTCCCCTTCAACCA-3′，下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；内参U6上游引物5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应条件：95 ℃变性10 s，65 ℃退火20 s；75 ℃延伸15 s，共40个循环，反应体系(20 μL)：包含cDNA、Power SYBR Green Master Mix和扩增引物等。采用2-ΔΔCt法计算miR-133a的相对表达量。血清BMP-2检测采用酶联免疫吸附法，室温下复融血清标本，使用SpectraMax iD5-多功能酶标仪(上海美谷分子仪器有限公司)检测BMP-2，试剂盒购自武汉博士德公司。

2 结果

2.1 两组血清miR-133a、BMP-2水平比较及二者相关性分析 延迟组血清miR-133a水平高于正常组，BMP-2水平低于正常组(P均<0.05)。见表2。延迟组血清miR-133a与BMP-2呈负相关(r=-0.418，P=0.022)。

表2 两组血清miR-133a水平、BMP-2水平比较

2.2 血清miR-133a与BMP-2对股骨颈骨折术后骨折愈合延迟的影响 高龄≥60岁、骨质疏松、血清miR-133a≥0.90、BMP-2<167.15 ng/L是骨折延迟愈合的危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响骨折愈合延迟的Logistic回归分析结果

2.3 血清miR-133a、BMP-2对股骨颈骨折术后骨折愈合延迟的预测效能 miR-133a、BMP-2预测股骨颈骨折术后骨折愈合延迟的截断值为2.03、129.35 ng/L，曲线下面积分别为0.771、0.678，miR-133a联合BMP-2预测股骨颈骨折术后骨折愈合延迟的AUC为0.915，高于单独指标(P均<0.01)，见表4。

表4 miR-133a、BMP-2对股骨颈骨折术后骨折愈合延迟的预测效能

3 讨论

骨折愈合是一个复杂的修复过程，主要分为炎症反应、软骨痂形成、硬骨痂形成和骨重塑4个阶段，损伤诱导的血肿和炎症反应驱使骨膜、骨内膜和骨髓的间充质细胞向骨折部位凝聚并向软骨细胞和成骨细胞分化，同时成骨细胞分化增加，促使骨膜上膜内骨在骨折间隙形成坚固的骨支架，骨支架扩张桥接骨折端，矿化形成坚硬的硬骨痂，硬骨痂在破骨细胞和成骨细胞相互作用下发生骨重塑，重建正常的骨几何形状，实现刚性固定[4]。然而5%～10%的患者术后骨折愈合延迟或难以愈合，年龄大、糖尿病、吸烟、局部感染、营养缺乏、软组织损伤加重、筋膜室综合征等是骨折延迟愈合的危险因素[5]。

miRNA是内源性单链非编码RNA，通过与信使RNA结合来调节多种生物过程，其中包括骨形成过程[6]。miR-133a是一种高度保守miRNA，从与miR-1相同的染色体位点转录而来，在心肌组织中大量表达，参与心脏疾病以及心血管疾病的发生，同时还涉及结直肠癌、肝细胞癌等多种癌症过程[7-8]。miR-133a在骨骼肌间充质干细胞中也有丰富表达，可调控骨骼肌发育以及骨代谢过程。已有研究表明，miR-133a是骨细胞分化的负向调节因子[9]。动物实验显示，miR-133a在雌激素缺乏诱导的骨质疏小鼠中表达上调[10]。ANASTASILAKIS等[11]研究发现，绝经后骨质疏松患者外周循环血中miR-133a表达上调，接受抗骨质疏松治疗后miR-133a表达下调。此外，MENCIA等[12]报道，局部使用含miR-133a抑制复合物的多孔胶原—纳米羟基磷灰石支架可上调runt相关转录因子2(Runx2)表达，增强间充质干细胞介导的成骨细胞分化。本研究结果显示，延迟组术后血清miR-133a水平增高，回归分析结果显示miR-133a与股骨颈骨折延迟愈合有关，miR-133a升高是骨折延迟愈合的危险因素之一，表明miR-133a升高可能抑制骨折术后骨形成过程。分析其机制包括：首先，Runx2是间充质干细胞成骨细胞分化的主要调节因子，参与成骨细胞分化过程[13]，Runx2是miR-133a的直接靶标，miR-133a通过直接靶向Runx2抑制成骨分化。其次，维生素K环氧化物还原酶复合亚基1对骨钙素γ-羧化和骨代谢具有重要作用，骨钙素在骨矿化过程中由成骨细胞合成，骨钙素γ-羧化可增强对钙离子的亲和力，γ-羧化失败降低对钙离子的亲和力和骨质量，而miR-133a可直接调控维生素K环氧化物还原酶复合亚基的表达，抑制骨钙素γ-羧化和骨形成[14]，导致骨折愈合延迟。

BMP-2属于转化生长因子β超家族的成员，是一种骨源性骨诱导细胞因子，具有诱导成骨的能力。研究显示，将BMP植入骨骼外软组织后可促进间充质干细胞分化成软骨细胞和成骨细胞，刺激骨形成，增加硬骨痂的发育和骨痂强度。除诱导骨形成外，在骨祖细胞旁分泌信号传导下，BMP-2还可促使新生血管形成，为骨再生提供血管供应[15]。BMP-2在骨折愈合中起重要作用，软骨细胞BMP-2的缺失可导致骨折愈合无法启动，或软骨愈伤组织的形成时间延长，从而影响骨折愈合过程[16]。动物实验显示，对去卵巢骨折小鼠给予重组人BMP-2后，可促使去卵巢小鼠骨折愈合[17]。GAO等[16]报道，骨折术后恢复良好患者的血清BMP-2水平显著高于恢复较差患者，血清BMP-2水平可作为股骨颈骨折髋关节置换术后恢复的标志物。在骨间充质干细胞的成骨分化过程中，高水平的BMP-2可直接诱导信号转导器Smad-1/5/9的磷酸化，促进骨组织分化和骨折愈合[18]，BMP-2缺乏其骨诱导能力降低，因此骨折愈合延迟。本研究结果显示，延迟组血清BMP-2水平低于正常组，回归分析结果显示BMP-2水平降低是股骨颈骨折患者术后骨折延迟愈合的危险因素，说明BMP-2缺失可能导致骨折术后骨愈合延迟。

研究显示，miR-133a可通过靶向调控Runx2，抑制RUNX2/BMP2信号通路传导，抑制骨形成，负向调节骨折愈合过程[8]。本研究相关性分析结果显示miR-133a与BMP-2呈负相关，提示miR-133a、BMP-2在骨折术后骨折愈合过程中具有相互抑制作用，血清miR-133a升高可能抑制BMP-2活性，降低其骨诱导能力，导致骨折愈合延迟。ROC分析结果显示，miR-133a联合BMP-2可较好地预测股骨颈骨折术后骨折延迟愈合风险，说明检测血清miR-133a、BMP-2可为临床骨折延迟愈合预防提供有效信息，指导临床治疗。回归分析结果显示，高龄、骨质疏松也与骨折延迟愈合有关，提示临床应针对高危患者进行干预，促使骨折愈合。

综上所述，股骨颈骨折延迟愈合患者术后血清miR-133a水平升高，BMP-2水平下降，miR-133a水平升高、BMP-2水平降低是骨折延迟愈合的危险因素，miR-133a可能通过负向调控BMP-2参与骨折愈合延迟的过程；联合检测miR-133a和BMP-2可为骨折延迟愈合评估提供可靠信息。