陈沛芬，赖瑾瑜，邝永培

南方医科大学附属东莞市人民医院超声科，广东东莞523059

在女性恶性肿瘤中，乳腺癌的发病率及病死率均列首位。乳腺癌的早期诊断可为治疗争取时机，改善治疗结局。二维超声作为乳腺肿块最主要筛查方式，可有效发现肿块存在，但在肿块良恶性鉴别方面的准确性欠佳。超声造影技术被称为“超声技术的第三次革命”，在肿瘤早期筛查中的敏感性、准确性均大幅提升[1]。研究显示，超声造影参数上升支斜率、曲线下面积(AUC)等与乳腺癌恶性程度相关[2-3]。乳腺癌细胞增殖、侵袭、自噬基因表达量可直接客观反映细胞增殖、侵袭、自噬活性，进而间接反映乳腺癌的恶性程度[4-5]。增殖基因丙酮酸激酶M2(PKM2)、侵袭基因Gab2、自噬基因ATG2B的表达水平是肿瘤细胞生物学行为的量化表现，其水平异常可反映肿瘤细胞的恶性生物学行为。基于此，本研究分析超声造影参数与乳腺癌患者恶性生物学行为相关基因的相关性，旨在提升超声诊断乳腺癌的临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年6月—2019年12月在我院接受乳腺手术治疗的120例女性乳腺癌患者作为观察组，年龄34～75(55.08±7.85)岁。均经病理检查确诊，其中浸润性导管癌111例、导管内原位癌9例，临床分期Ⅰ期20例，Ⅱ期29例，Ⅲ期41例，Ⅳ期30例。患者均为首诊，术前未行抗肿瘤治疗。排除标准：合并其他组织脏器恶性肿瘤性疾病；妊娠期或哺乳期；合并乳腺局部或全身感染性疾病。另选取120例女性乳腺腺纤维瘤患者作为对照组，年龄31～77(56.12±8.57)岁。两组年龄具有可比性(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会审核批准，患者及家属知情并签署知情承诺书。

1.2 超声造影检查 采用Aplio 500彩色多普勒超声诊断仪。患者入院后先行二维超声检查，了解病灶位置、数目、大小、内部回声、质地、血流灌注、是否合并微钙化等；固定探头位置，切换至造影模式，20 mL造影剂Sono Vue与5 mL生理盐水混匀，抽取4.8 mL经肘正中静脉推注，随后快速注入5 mL生理盐水冲管。通过超声诊断仪观察病灶处动态灌注，利用Qontrast软件计算时间—强度曲线中达峰强度(PI)、AUC，其中PI反映微血管密度，AUC反映血流灌注。以二者平均值为界，小于等于平均值为低水平，大于平均值为高水平。

1.3 肿瘤组织PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表达检测 采用荧光定量PCR法。取冻存的手术切除肿瘤组织标本，加入细胞裂解液，以3 500 r/min离心10 min，取无色水相。异硫氰酸胍—酚—氯仿一步法提取总RNA，逆转录合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列：PKM2上游5′-ACAGCTGTGTGGTGCTTCTGTG-3′，下游5′-CATTGTCCTCTGTCCAGGCATC-3′；Gab2上游5 ′-CATCATTCACCCTTGGCACAGGTGT-3′，下游5′-TGATCCCAAGTGGTCCACCCCAAC-3′；ATG2B上游5′-CTTGCCCCTTTCGTCTATTTG-3′，下游5′-TACGGCCCTGAAGTACAGTCTT-3′。扩增体系：逆转录产物5 μL，寡聚核苷酸引物各为400 nmol/L，探针150 nmol/L，dATP、dCTP和dGTP各200 μmol/L，dUTP 400 μmol/L，10×缓冲液5 μL，MgCl25 mmol/L，TaqDNA聚合酶1.25 U，尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)0.5 U。扩增条件：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min；94 ℃ 30 s，66 ℃1 min，共40个循环。在7700 Sequence Detector分析仪上测定标准品和标本中PKM2、Gab2、ATG2B含量，根据标准曲线计算PKM2、Gab2、ATG2B mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 两组PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表达水平比较 观察组PKM2、Gab2 mRNA表达水平高于对照组，ATG2B mRNA表达水平低于对照组(P均<0.05)。见表1。

2.2 不同临床分期乳腺癌患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表达水平比较 临床分期Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者PKM2、Gab2 mRNA表达水平低于Ⅲ～Ⅳ期，ATG2B mRNA表达水平高于Ⅲ～Ⅳ期(P均<0.05)。见表2。

表1 两组PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表达水平比较

表2 不同临床分期乳腺癌患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表达水平比较

2.3 两组超声造影参数比较 观察组PI、AUC均高于对照组(P均<0.05)。见表3。

表3 两组超声造影参数比较

2.4 不同超声造影参数水平患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表达水平比较 乳腺癌PI、AUC高水平患者PKM2、Gab2 mRNA表达水平高于低水平患者，ATG2B mRNA表达量低于低水平患者(P均<0.05)。见表4。

表4 不同超声造影参数水平患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表达水平比较

2.5 乳腺癌患者超声造影参数与PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表达的相关性 在乳腺癌患者中，PI与PKM2、Gab2 mRNA表达呈正相关(r分别为0.518、0.388，P均<0.05)，与ATG2B mRNA表达呈负相关(r=-0.646，P<0.05)；AUC与PKM2、Gab2 mRNA表达呈正相关(r分别为0.506、0.486，P均<0.05)，与ATG2B mRNA表达呈负相关(r=-0.559，P<0.05)。

3 讨论

超声造影可直观地观察乳腺癌恶性转化及发生发展过程中血管构筑变化与相应血流动力学变化，主要体现在血管数量、形态、结构、空间分布及灌注功能的改变[6-7]。研究显示，血管生成能力可预测良性增生组织的恶性倾向[8-9]。超声造影参数时间—强度曲线中PI动态增强扫描开始至肿瘤浓度达峰所需时间，反映血管阻力，可反映微血管密度，AUC描述整个动态增强周期内肿瘤组织对比剂浓度变化趋势，可反映病灶组织血流灌注及通透性，在乳腺癌发生发展过程中，时间—强度曲线中PI、AUC逐渐增高[10]。本研究结果显示，观察组超声造影参数PI、AUC水平高于对照组，提示乳腺癌组织中血流灌注更多，与其肿瘤特性相吻合。

乳腺癌细胞恶性增殖与促增殖/抗增殖基因表达失衡直接相关，对细胞增殖相关基因表达量进行检测，可反映乳腺癌细胞的增殖活性，评估其恶性程度[11]。PK是细胞糖酵解通路的限速酶，也是肿瘤代谢异常的关键酶。PK有四种同工酶形式(M1、M2、L、R)，在肿瘤形成过程中，其他三种同工酶逐渐消失，PKM2则大量表达。肿瘤细胞PKM2的酪氨酸与丝氨酸位点会发生磷酸化，PKM2上磷酸酪氨酸可促进1，6二磷酸果糖释放，四聚体转变为二聚体，进而使糖酵解向生物合成转变，加速有氧糖酵解，促进肿瘤发展[12]。研究显示，肿瘤组织中PKM2高表达，作为转录辅助因子可参与细胞耐药及有丝分裂、增殖周期调节，下调PKM2表达可对凋亡相关蛋白表达产生影响，促进肿瘤细胞凋亡[13]。本研究结果显示，观察组乳腺癌组织中PKM2 mRNA表达量高于对照组，且临床分期Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者PKM2 mRNA表达水平低于Ⅲ～Ⅳ期，表明PKM2表达异常参与了乳腺癌的发生发展。

肿瘤恶性进展后可出现远处侵袭转移，导致预后不佳，该过程有较多侵袭相关基因参与。Gab2是肿瘤相关蛋白，在卵巢癌、卵巢癌等中呈异常高表达，与肿瘤侵袭转移密切相关[14-15]。研究表明，Gab2可通过PI3K/Akt/ARK5信号通路影响基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP-9表达，进而促进乳腺癌的侵袭与转移[16]。自噬功能异常是癌症发生的重要因素之一。ATG2B是典型的自噬相关基因，可调控溶酶体降解受损细胞器和大分子，诱导细胞凋亡进程[17]。本研究结果显示，观察组Gab2 mRNA表达量高于对照组，且Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者表达量高于Ⅰ～Ⅱ期患者；ATG2B mRNA表达量低于对照组，且Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者表达量低于Ⅰ～Ⅱ期患者。这表明Gab2、ATG2B表达异常与乳腺癌发生及侵袭转移有关。

探讨超声造影与分子生物学指标的联系，可对临床治疗和预后评估方面提供更全面的依据。本研究结果显示，乳腺癌超声造影PI、AUC高水平患者PKM2、Gab2 mRNA表达高于低水平患者，ATG2B mRNA表达低于低水平患者，且PI、AUC水平与PKM2、Gab2 mRNA表达呈正相关，与ATG2B mRNA表达呈负相关。提示超声造影参数水平与乳腺癌患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表达水平相关，可在一定程度上反映乳腺癌细胞的增殖活性、侵袭活性及自噬活性。

综上所述，乳腺癌患者超声造影参数水平及PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表达异于良性肿瘤者，且具体参数水平与PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表达量直接相关，可作为早期筛查疾病、评估恶性程度的可靠手段。降低PKM2、Gab2 mRNA表达，提高ATG2B mRNA表达有望成为控制乳腺癌侵袭转移的靶点。