刘佳斌,张杨,王茗悦,黄剑梅,靖传旭,宋小凯,徐立新,严若峰,李祥瑞

(南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095)

鸡球虫病(Coccidiosis)是由顶复门艾美耳属(Eimeria)的球虫寄生于鸡的肠道引起的重要寄生性原虫病[1],其在世界范围内对养禽业造成巨大的经济损失[2],不同艾美球虫的寄生部位表现出高度的特异性[3],如堆型艾美耳球虫专一寄生于鸡的十二指肠,严重感染时可寄生于小肠中段,入侵并在肠上皮细胞内发育。流行病学调查显示,感染艾美耳球虫鸡的发病率和死亡率可以高达80%以上[4]。鸡球虫病每年在世界范围内对家禽养殖业所造成的损失高达约30亿美元[5-6],引起的全球性兽医卫生问题被高度关注。目前世界上得到公认的鸡球虫有7种,其中巨型艾美耳球虫(Eimeriamaxima)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)在世界范围内危害较为严重[4]。

不断发展的基因操作和基因测序技术为研究顶复门原虫的微线蛋白(micronemes,MIC)功能提供了便利。现有研究显示MIC与鸡艾美耳球虫入侵宿主靶细胞的能力相关[7-11]。鸡艾美耳球虫入侵宿主细胞的过程就是宿主上皮细胞的特异性受体与虫体分泌释出的微线蛋白的结合与脱离。本课题组前期研究发现[12]:堆型艾美耳球虫的微线蛋白3(EaMIC3)能够特异性结合十二指肠上皮细胞,且该蛋白对堆型艾美耳球虫的入侵具有较好的免疫保护力;EaMIC3的7个微线蛋白黏附重复结构域(microneme adhesive regions,MAR)中黏附重复结构域3(EaMAR3)与鸡十二指肠的结合能力最强,而黏附重复结构域6(EaMAR6)与十二指肠的结合能力较弱。因此,本研究对堆型艾美耳球虫侵入过程中的关键蛋白MIC3及其结构域蛋白进行动物免疫保护试验,对比EaMIC3蛋白和结构域蛋白的免疫保护效果,为鸡球虫亚单位疫苗的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与虫株

1日龄海兰白蛋鸡购自江苏省海安市某鸡场,新西兰白兔购自江苏省浦口莱芙养殖场。

E.acervulina江苏分离株(JS strain)由南京农业大学兽医寄生虫病实验室分离、纯化,保存于2.5 g·L-1重铬酸钾溶液中,于4 ℃放置,每5个月复苏1次,确保卵囊的活性。

1.2 主要试剂

山羊抗兔IgG(Y)抗体购自BioWorld公司;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氨苄青霉素为南京生兴公司产品;BSA购自DSBIO公司;His标签蛋白纯化镍柱为GE Healthcare公司产品;IPTG购自上海生工生物公司;TMB培养基购自Sigma公司;6× Protein Loading 购自Thermo scientific 公司。

1.3 重组蛋白EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6的诱导表达及纯化

按体积比1∶100的比例将含有pET-32a-EaMIC3、pET-32a-EaMAR3、pET-32a-EaMAR6质粒的菌液和pET-32a菌液(本课题组张振超博士提供)分别接种至1 L含有50 μg·mL-1氨苄青霉素的LB培养基中,细菌培养至对数生长期(D600≈0.6),添加终浓度为1 mmol·L-1的IPTG进行诱导表达。离心后收集菌体沉淀,用PBS洗涤菌体3次,用上清结合缓冲液重悬沉淀,-20 ℃反复冻融3次后,超声破碎。7 800 r·min-1离心15 min,上清液转移至新的50 mL离心管,上清液用上清结合缓冲液重悬、沉淀用包涵体结合缓冲液重悬,4 ℃溶解过夜。分别取上清液和包涵体,加入5×蛋白样上缓冲液,沸水浴中作用5～8 min,进行SDS-PAGE。检测上清液和包涵体的表达情况,以确定蛋白的表达部位。

包涵体结合缓冲液溶解的蛋白沉淀在4 ℃、7 800 r·min-1离心15 min,收集上清液,经0.22 μm滤器过滤杂质后,通过His标签蛋白纯化柱(His-Trap FF)纯化重组蛋白[12]。

1.4 重组蛋白EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6多克隆抗体制备

将纯化后的pET-32a标签蛋白、pET-32a-EaMIC3、pET-32a-EaMAR3、pET-32a-EaMAR6重组蛋白(500 μg)分别免疫2只6周龄的雄性健康新西兰白兔,制备抗血清。初次免疫时,在乳化仪中加入蛋白和等量的弗氏完全佐剂,乳化10～15 min,采用背部多点法皮下注射。2周后,加入等量蛋白和弗氏不完全佐剂混匀后充分乳化,加强免疫1次,然后每周免疫1次。5次免疫后采用心脏采血法收集血液,分离血清,获得多克隆抗体。

1.5 重组蛋白抗血清抗体效价检测

多克隆抗体效价检测:以3种重组蛋白和pET-32a标签蛋白分别为抗原包被ELISA板,每孔100 ng,用间接ELISA方法检测兔抗重组蛋白血清的抗体效价。

免疫后鸡血清中特异性抗体水平检测:以pET-32a-EaMIC3为抗原包被ELISA板,将其溶于0.05 mol·L-1碳酸盐溶液(pH9.6),调节其蛋白浓度为50 μg·mL-1,在96孔酶标板中每孔加入100 μL,4 ℃过夜;弃去包被液,用PBST洗3次,每次5 min。每孔加入200 μL含5% BSA的PBST,37 ℃封闭1 h;弃去封闭液,用PBST洗涤3次,每孔加入100 μL 1∶50稀释过的各待测血清样品,37 ℃孵育2 h;弃去液体,用PBST洗涤3次,每孔添加100 μL封闭液稀释过(1∶10 000)的HRP标记的二抗,室温反应37 ℃ 1 h;弃去液体,用PBST洗涤3次,每孔添加100 μL TMB培养液,室温避光5 min后,每孔添加100 μL 2 mol·L-1H2SO4,终止反应;放入酶标仪检测D450值。

1.6 堆形艾美耳球虫孢子化卵囊收集

取2周龄海兰白鸡20只,每只经口灌服1.2×105个孢子化卵囊,收集感染后4～5 d的粪便[13],采用饱和盐水漂浮法从粪便中收集卵囊,存于2.5g·L-1重铬酸钾溶液中,并在25 ℃恒温培养箱中进行卵囊孢子化,然后4 ℃保存待用。

1.7 分组与免疫

重组蛋白免疫:将健康状况良好、体重差异不大的14日龄雏鸡随机分为6组(每组20只),设置pET32a载体蛋白(腿部肌肉注射载体蛋白)、感染非免疫(腿部肌肉注射PBS)和非感染非免疫3个对照组;另外 3组分别用原核表达蛋白EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6在14日龄时进行首次免疫,腿部肌肉注射,每羽 200 μg。21日龄时进行第2次免疫。28日龄时进行攻虫,每只鸡经口感染1.2×105个孢子化卵囊,7日后剖杀。

重组蛋白抗血清保护试验:将60只体重差异不大、健康状况良好的28日龄雏鸡攻虫,每只鸡经口感染1.2×105个孢子化卵囊,随机均分为3组,并设置抗pET-32a标签蛋白血清组(翅静脉注射抗标签蛋白血清)、感染非免疫(翅静脉注射PBS)和非感染非免疫组,连续7 d进行翅静脉注射,每羽注射0.5 mL效价为212的抗重组蛋白多抗血清,第8天剖杀。

1.8 免疫保护性效果观察

堆型艾美耳球虫致病程度与鸡的增重、肠道病变等指标相关,通过观察增重、肠道病变计分、肠道内容物卵囊数等得出抗球虫指数,继而进行统计分析,对此次动物试验的免疫效果进行全面评价。

1.8.1 增重指标试验动物逐只称量、攻虫时体重(m1)和剖杀时体重(m2)并记录,计算平均增重(W1)、增重率、相对增重率及存活率,参照索勋等[14]的计算方法进行。

1.8.2 肠内容物卵囊数(OPG)使用麦克马斯特法(McMaster’s method)计算每克肠道内容物的卵囊数,以对数(lg)表示;根据试验组卵囊数占感染非免疫组比例,进行分数换算[12],得出卵囊值。

1.8.3 卵囊减少率与病变值参照文献[14]的方法计算卵囊的减少率。E.acervulina病变位置为十二指肠,肉眼病变计分参照索勋等的方法[14]。病变值(0～40)=每组动物平均病变记分(0～4)×10。

1.8.4 抗球虫指数(ACI)抗球虫指数(ACI)是将存活率、增重变化效果、肠道病变值和卵囊数量等多项参数进行综合分析和评定,是判定球虫耐药性、药物抗球虫效力或球虫疫苗免疫效果等的指标。参数和判定公式:ACI=(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)。ACI≥180,表示保护效果明显;160

1.9 数据的统计分析

使用SPSS 20.0统计软件进行统计和分析,组间差异显著性分析使用单因素邓肯多重比较分析(ANOVA)。分析0.05、0.01和0.001水平的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 重组蛋白EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6的诱导表达及纯化

构建成功的原核表达质粒pET-32a-EaMIC3、pET-32a-EaMAR3、pET-32a-EaMAR6转入BL21大肠杆菌,用IPTG诱导小量表达,以pET-32a为空载体对照,探索表达条件。诱导表达结果如图1。纯化结果如图2,pET-32a-EaMIC3(图2-a)、pET-32a-EaMAR3(图2-b)、pET-32a-EaMAR6(图2-c)分别在相对分子质量111×103、29×103、29×103附近出现单一条带,说明纯化效果良好。

图1 SDS-PAGE分析pET-32a(+)-EaMIC3(a)、pET-32a(+)-EaMAR3(b)、pET-32a(+)-EaMAR6(c)的时相表达Fig.1 The expression of pET-32a(+)-EaMIC3(a),pET-32a(+)-EaMAR3(b)and pET-32a(+)-EaMAR6(c) in different time analyzed by SDS-PAGE M. 标准蛋白Standard protein molecular marker;1～6. 蛋白诱导表达0～5 h后的BL21裂解物 Protein induced by IPTG for 0-5 h;7～8. pET-32a(+)在诱导表达0和5 h后的BL21裂解物 pET-32a(+)induced by IPTG for 0 and 5 h.

图2 SDS-PAGE分析重组蛋白EaMIC3(a)、EaMAR3(b)、EaMAR6(c)的纯化效果Fig.2 The purified effect of recombinant protein of EaMIC3(a),EaMIC3-MAR3(b)and EaMIC3-MAR6(c)analysed by SDS-PAGE M. 标准蛋白Standard protein molecular marker;1～3.纯化后的重组蛋白EaMIC3、EaMAR3和EaMAR6 Purified protein of EaMIC3,EaMAR3 and EaMAR6.

2.2 EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6重组蛋白兔抗血清的效价

第5次免疫后用间接ELISA法检测兔血清中pET-32a-EaMIC3、pET-32a-EaMAR3、pET-32a-EaMAR6、pET-32a蛋白抗体的效价分别为216、216、213、216。

2.3 重组蛋白EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6抗E.acervulina效果

2.3.1 增重变化感染非免疫与非感染对照组增重相比差异显著降低,说明每组试验动物成功感染E.acervulina。pET-32a标签蛋白组与感染非免疫组增重变化差异不显著,说明其对感染球虫的鸡无明显保护作用。重组蛋白试验组鸡的增重与感染非免疫组比较差异显著,说明3种重组蛋白对感染鸡E.acervulina具有保护效果(表1)。

表1 免疫鸡以E.acervulina攻虫后的抗球虫指数分析Table 1 Protective effect of recombinant proteins against E.acervulina

2.3.2 肠道病变计分和卵囊产量肠道病变计分表示的是肠道受损伤程度。攻虫后1周,取肠内容物进行卵囊计数。结果(表1)显示:pET-32a标签蛋白组与感染非免疫组比较,病变计分和卵囊减少率差异不显著,说明攻虫成功且pET-32a标签蛋白没有抗球虫作用。重组蛋白试验组鸡的病变计分和卵囊减少率与感染非免疫组比较均差异显著,说明重组蛋白对鸡抵抗球虫感染具备一定保护作用。

2.3.3 抗球虫指数(ACI)从表1可以看出:pET-32a标签蛋白组与感染非免疫组相比较ACI差异不显著,说明pET-32a标签蛋白没有抗球虫作用。而EaMIC3,EaMAR3组ACI值都在160以上,说明其对鸡具有抗球虫保护效果,而EaMAR6组的ACI值在160以下,说明其对鸡抗球虫免疫保护效果不显著。

2.3.4 鸡血清中抗重组蛋白特异性抗体水平血清样品于雏鸡首免后14 d(二免后7 d)采集,使用ELISA方法检测血清中EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6特异性IgG浓度。试验结果(图3)显示:重组蛋白EaMIC3免疫组血清特异性抗体水平在二免后7 d均显著高于各对照组(P<0.05)。证实EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6可刺激体液免疫产生。

图3 鸡血清中EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6 特异性IgG水平Fig.3 IgG level in chicken serum of EaMIC3, EaMAR3,EaMAR6

2.4 抗重组蛋白EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6血清免疫保护性效果

2.4.1 增重变化感染非免疫组与非感染非免疫组相比增重差异显著(表2),说明每组试验动物成功感染E.acervulina。pET-32a标签蛋白血清组与感染非免疫组比较差异不显著,说明其对感染球虫的鸡无明显保护作用。每个试验组鸡的体重与感染非免疫组比较差异显著,说明 3种抗重组蛋白血清对感染鸡E.acervulina具有保护效果。

2.4.2 肠道病变计分和卵囊产量肠道病变记分(表2)表示的是肠道受损伤程度。经过分析比较发现抗pET-32a标签蛋白血清组与感染非免疫组比较,病变计分和卵囊减少率差异较小,说明攻虫成功且pET-32a标签蛋白没有抗球虫作用。所有试验组鸡的病变计分和卵囊减少率与感染非免疫组比较差异显著,说明重组蛋白对鸡抵抗球虫感染具备一定保护作用。

2.4.3 抗球虫指数(ACI)从表2可以看出:抗pET-32a标签蛋白血清组与感染非免疫组ACI差异不显著,说明抗pET-32a标签蛋白血清没有抗球虫作用。其中试验组抗重组蛋白EaMIC3、EaMAR3血清组ACI都在160以上,说明其对鸡球虫具有一定抵抗力。抗重组蛋白EaMAR6血清组的ACI在160以下,说明其对鸡不具有抗球虫保护效果。

表2 免疫鸡以E.acervulina攻虫后的抗球虫分析Table 2 Protective effect of recombinant protein against E.acervulina

3 讨论

鸡球虫病在禽业生产中危害极大[14-15],现阶段的养鸡业中使用抗球虫化学药物是鸡球虫病的主要防治手段[16]。随着耐药性和食品安全问题逐渐显现,通过疫苗免疫来预防球虫病已经成为趋势[17],目前用于防治的是球虫活疫苗和亚单位疫苗[12]。由于活疫苗存在成本高、接种剂量不易掌控等风险,因此寻求更高效、安全的途径防治鸡球虫尤为关键。近年来,许多采用基因工程技术研制重组亚单位抗球虫疫苗及其在家禽养殖中应用的研究被报道[18-25]。除了CoxAbic以外,至今没有其他任何商业化产品上市,CoxAbic是由以色列雅贝克公司从艾美耳球虫的配子体中分离而得的亚单位疫苗[26-27]。国内则相对缺少堆型艾美耳球虫亚单位疫苗研发的信息。

本课题组致力于研究、开发抗球虫的重组亚单位疫苗,以寄生虫感染过程中先天性及适应性的响应机制等为基础[28]。前期研究表明,EaMIC3在堆型艾美耳球虫子孢子侵入肠上皮细胞过程中发挥关键作用,其MAR3是侵入的关键结构域。本试验选择MIC3和MAR3蛋白为研究对象,利用重组蛋白及抗重组蛋白血清,通过动物保护性试验进一步证明EaMIC3及MAR3在虫体侵入中的关键作用,为亚单位疫苗筛选提供参考。

研究数据显示,EaMIC3和结构域蛋白的免疫保护作用有所差异,且全蛋白表现出良好的免疫保护作用,说明EaMIC3可以作为抗E.acervulina的候选疫苗抗原,结构域蛋白的免疫保护能力与其同十二指肠上皮细胞结合能力有相关性,即在细胞ELISA试验中,与十二指肠上皮细胞结合能力最强的结构域蛋白EaMAR3表现出具有免疫保护作用,而结合能力较弱的EaMAR6则未显示出免疫保护作用,但若以EaMAR3为抗原制备亚单位疫苗,还需要更深入研究。对3种蛋白进行比较分析,发现某些结构域具有较好的免疫保护效果,但是要发挥更好的免疫作用,可能需要其他结构域蛋白共同作用。