周显青，于子越

河南工业大学 粮油食品学院，粮食储藏与安全教育部工程研究中心,河南 郑州 450001

糯米淀粉中支链淀粉的含量占比大且分子量极高，糯米在蒸煮后具有黏度大、酶水解率低的特点，所以通常是以糯米粉的形式应用于食品工业。据不完全统计，2009年我国糯米粉的生产厂家已有600多家，年产量300多万t，并且随着糯米粉产业的发展，糯米粉年产量还在增加[1]。研究糯米粉的加工特性，对糯米制品品质的提高具有重要意义。糊化特性是糯米粉非常重要的特性之一，而蛋白质作为大米中第二大成分，对大米的糊化特性有重要影响。Baxter等[2]研究发现，随着添加的球蛋白浓度的增加，淀粉糊化温度和RVA黏度均呈线性下降,谷蛋白浓度的增加使淀粉糊化温度几乎呈线性上升，RVA黏度呈近似线性下降，并且谷蛋白对淀粉的黏度影响更大。然而，外部加入的蛋白与淀粉之间形成的作用力和天然大米粉内蛋白与淀粉之间的作用力是不同的[3]，外部加入的蛋白对大米粉糊化特性的影响与自然状态下大米粉中蛋白的影响也不同，所以通过酶解大米中的蛋白来研究脱蛋白处理对大米粉糊化特性的影响。研究发现减少大米粉中的蛋白质能够使糊化黏度曲线整体升高，并使糊化温度降低和峰值时间减少[4]。徐晶冰[5]研究发现脱除的蛋白越多，早籼米粉颗粒表面越光滑，峰值黏度、衰减值、回生值越低。也有学者重点研究蛋白质本身的结构和分子量对大米糊化特性的影响，如高文明[6]研究发现去除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白后，籼米粉糊化峰值黏度、热糊黏度和最终黏度有不同程度的增加，崩解值、糊化温度都有降低趋势，并且蛋白亚基中33.29 kDa和19.90 kDa亚基是影响这些糊化指标变化的主要亚基；郭玉宝[7]通过傅里叶红外光谱研究陈化过程中粳米蛋白质自身变化对糊化特性的影响机理，研究发现样品经过储藏陈化，清蛋白和谷蛋白与淀粉分子的结合变得更为疏松，相互作用减弱，而球蛋白与淀粉分子间的相互作用加强，蛋白的这些变化对样品的多个糊化指标都产生了重要影响。目前主要研究籼米、粳米中不同蛋白组分及不同蛋白含量对糊化特性的影响，但是关于糯米中不同蛋白组分对其糊化特性的影响及机理还尚不清楚。基于此，作者利用溶解度的不同分级去除糯米粉中不同蛋白组分，通过测定样品溶解度和膨润力的变化、微观结构中淀粉蛋白结合方式的变化、结合水能力变化、淀粉体系氢键的变化来探究不同蛋白组分对糊化特性的影响机制。通过研究蛋白组分对糯米粉的糊化特性的影响及机制，可以更加了解不同种类蛋白质在糯米粉糊化特性方面的作用，为糯米粉应用和加工品质的提高提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

籼糯稻谷：2019产于河南省信阳市潢川县，其糙米的长宽比为2.52，出糙率、出米率、整精米率分别为75.28%、66.03%、32.61%，气味、色泽均正常。

正己烷、氢氧化钠、无水乙醇、氯化钠：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；盐酸：分析纯，信阳市化学试剂厂；溴化钾：光谱纯，赛默飞世尔科技公司。

1.2 主要仪器设备

MNMS18型砂辊碾米机：湖北永祥粮食机械股份有限公司；101型电热鼓风干燥箱：北京市光明医疗仪器有限公司；JXFM110型锤式旋风磨：上海嘉定粮油仪器有限公司；RVA-TecMaster快速黏度分析仪：澳大利亚波通公司；LXJ-IIB型低速大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；ATX224型分析天平：日本Shimadzu公司；MicroMR-CL-1变温型核磁共振食品农业成像分析仪、Quanta250FEG扫描电子显微镜：上海纽迈电子科技有限公司；Nicolet-6700傅里叶红外光谱仪：赛默飞世尔科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 糯米粉蛋白组分分离

对稻谷分别去杂、砻谷、碾米，再使用锤式旋风磨进行磨粉，过100目筛，得到糯米粉。对糯米粉进行脱脂和蛋白组分分离[8]。以未处理的为参照样(I)。称取40 g脱脂糯米粉，加入280 mL蒸馏水搅拌4 h，4 500 r/min离心10 min，去上清液后的沉淀为去清蛋白样品(Ⅱ)；对样品Ⅱ加入5% 280 mL NaCl溶液搅拌4 h，4 500 r/min离心10 min，去上清液后的沉淀为去清蛋白、球蛋白样品(Ⅲ)；对样品Ⅲ加入0.05 mol/L 280 mL NaOH溶液搅拌4 h，4 500 r/min离心10 min，去上清液后的沉淀为去清蛋白、球蛋白和谷蛋白样品(Ⅳ)；对样品Ⅳ加入70% 280 mL乙醇溶液搅拌4 h，4 500 r/min离心10 min，去上清液后的沉淀为去清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白样品(Ⅴ)。每种蛋白去除的步骤重复3次，样品Ⅱ和Ⅲ使用蒸馏水清洗3次，样品Ⅳ和Ⅴ先用2 mol/L HCl溶液调节pH值到7，再用蒸馏水清洗3次，最后将样品I—V在40 ℃干燥10 h，磨粉、过筛后于4 ℃下保存。

1.3.2 糊化特性的测定

参照GB/T 24852—2010中的方法测定。

1.3.3 溶解度和膨润力的测定

参考文献[9]的方法测定。称量0.5 g(m)糯米粉(干基)于离心管中，配制2%的粉乳液并混合均匀，在65 ℃下振荡加热30 min，冰浴5 min，以4 000 r/min离心20 min。将铝盒烘干到恒质量(m1)；将离心管中上清液倒入铝盒中，在105 ℃条件下烘干到恒质量(m2)；离心管(质量m3)加沉淀称质量(m4)。计算溶解度和膨润力。

1.3.4 扫描电子显微镜观察

参照王诗雁[10]的方法并略加修改，将样品固定在直径为1 cm的样品台上，然后用离子溅射仪喷金，扫描电压为3 kV，放大3 000倍之后进行观察。

1.3.5 核磁共振(NMR)测定

参照文献[5]中的方法并略加修改。将样品置于永久磁场中心位置的射频线圈的中心，进行CPMG脉冲序列试验。采样频率为200 kHz，点数TD=5 000，重复扫描64次。利用T2*-Fit 软件计算横向弛豫时间(T2)。T2衰减曲线经过弛豫模型的拟合和反演，可得到弛豫时间和弛豫信号分量。

1.3.6 傅里叶红外测定

参考文献[11]中的方法，将干燥后的溴化钾与样品依照质量比1∶ 100混合后，在玛瑙研钵中均匀研磨5 min，然后进行压片。扫描波数500～4 000 cm-1，扫描16次，分辨率4 cm-1。使用Omnic 8.0进行数据处理。

1.3.7 数据统计与分析

采用SPSS 20.0进行差异性分析和相关性分析，使用Origin 2018进行图表的制作。

2 结果与讨论

2.1 蛋白组分对样品糊化特性的影响

样品的RVA图谱见图1。由图1可知，蛋白质组分对糯米粉的RVA曲线有明显的影响，且不同种类的蛋白质具有不同的影响。依次去除清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白后，黏度曲线呈现整体下降趋势，更加趋向平缓。黏度曲线上升阶段，淀粉分子在热状态下体积迅速膨胀，造成黏度的快速增加[12]。黏度增加的最大值称为峰值黏度，主要表示淀粉颗粒在破裂前吸水膨胀的能力。由表1可知，球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白的去除都能使样品峰值黏度显著降低，影响最大的是谷蛋白，其次是球蛋白、醇溶蛋白。说明这3种蛋白都能提高样品吸水膨胀的能力。

图1 RVA图谱

峰值时间和糊化温度用于表征淀粉糊化的难易程度和水结合能力[13-14]。由表1可知，去除球蛋白和谷蛋白使峰值时间和糊化温度显著增加。去蛋白后，样品变得更难糊化，这个趋势与刘奕等[15]的研究结果相同，但是也有学者得出从米粉中去蛋白后，米粉更易糊化的结论。这可能是由于样品品种之间的差异造成的。糊化温度的升高可能是因为去除球蛋白和谷蛋白破坏了样品中淀粉颗粒表面的水化膜，使得水分活度减小，造成了糊化难度的提高[16]。

表1 样品的糊化特性指标

黏度曲线下降阶段是受到剪切力的作用，样品颗粒在膨胀到最大程度后开始破裂，体系黏度迅速降低，峰值黏度和最低黏度的差值为衰减值，表示的是淀粉糊在高温条件下耐剪切的能力及热稳定性[17]。球蛋白、谷蛋白以及醇溶蛋白的去除使样品衰减值显著降低，而清蛋白的影响不大。说明球蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白能够增加样品抗剪切能力及淀粉糊的稳定性。黏度曲线最后为上升阶段，是由于体系温度降低，淀粉分子开始凝聚，体系的黏度再次升高并稳定到一个值，称为最终黏度。最终黏度和最低黏度的差值为回生值，反映的是淀粉糊冷却后的稳定性和老化的趋势，淀粉糊的回生会造成淀粉凝胶硬度及韧性的增加[18]。去除球蛋白，样品回生值显著降低，再去除谷蛋白和醇溶蛋白，样品的回生值呈下降趋势，但是没有显著变化。这说明去除球蛋白可以使样品热糊稳定性降低，并能延缓老化，这与肖满凤等[19]的研究结论一致。总的来说，去除样品中蛋白组分后，样品黏度曲线变低、变平缓，并且曲线整体后移，表明更加难以糊化。去除谷蛋白对样品糊化特性影响最大，其次是球蛋白，最后是醇溶蛋白，而清蛋白对糊化特性没有显著的影响。

2.2 膨润力和溶解度

膨润力是淀粉颗粒在水中受热时吸水膨胀的能力[4]，可以用来解释样品糊化时整体黏度变化的部分原因。溶解度与淀粉颗粒内部结合力有关，淀粉结构越紧密、胶束越致密，则溶解度越低[20]。膨润力和溶解度在一定程度上能反映出糯米粉颗粒内淀粉与蛋白的结合能力和淀粉的持水能力。由图2可以看出，随着蛋白组分的去除，糯米粉溶解度呈增加的趋势，膨润力呈现降低的趋势。说明蛋白质的去除使样品在加热阶段的膨胀体积减小，淀粉溶解度增加。蛋白质的去除可能破坏了淀粉-蛋白之间的结构及作用力，影响了淀粉结构的紧密程度，从而影响淀粉的浸出和膨胀能力[21]。

图2 溶解度和膨润力

由图2可以看出，在去除球蛋白、谷蛋白时，样品的溶解度从4.33%升高到5.97%、从5.97%升高到8.91%。对于膨润力，去除谷蛋白时样品的膨润力变化最大，从8.14%降低到4.75%；其次是去除球蛋白，膨润力分别从9.31%降低到8.14%；然后是去除醇溶蛋白的样品，膨润力从4.75%降低到3.79%，3种蛋白去除都对样品的膨润力有显著影响。在去除谷蛋白时对样品溶解度和膨润力影响最大，其次是去除球蛋白的样品，而醇溶蛋白影响较小，去除清蛋白组分对样品没有显著的影响。由表2可以看出，样品的峰值黏度、衰减值、回生值与膨润力呈显著性正相关，与溶解度呈显著性负相关。说明随着蛋白组分的去除，样品的膨润力和峰值黏度、衰减值、回生值的变化有相同的趋势，这是因为糊化过程中，淀粉分子在热状态下体积迅速膨胀，造成黏度的快速增加[16]。去蛋白之后样品膨胀能力的减弱造成了糊化过程中黏度的降低。

表2 糊化特性指标与溶解度、膨润力的相关性

2.3 微观结构分析

通过分析样品的微观结构，可以直观地观测到去组分蛋白后，蛋白质与淀粉的结合方式的变化，在脱脂后，糯米粉中主要是蛋白质和淀粉。由图3a和3b可以看出，样品Ⅰ、样品Ⅱ的微观结构比较相似，多个淀粉颗粒通过蛋白以复合形式存在，形成一个大的糯米粉颗粒，且这种结合十分紧密，这与李玥[22]的研究结果一致。在去除清蛋白后，少量淀粉渐渐从大颗粒中析出，但整体微观结构没有明显的变化，样品的糊化特性也没有显著的变化；由图3c、3d和3e可以看出，去除球蛋白后，大量淀粉颗粒析出，样品以分散的小颗粒状态存在，但表面还有很多蛋白，使样品Ⅲ整体呈现不规则多面体结构，棱角较明显；在去除谷蛋白后，淀粉表面的蛋白也被慢慢去除干净，使样品Ⅳ呈现出平滑和圆润的特征；再去除醇溶蛋白，样品变得更加圆滑。球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白的去除，使得淀粉逐步从蛋白的包裹和限制中释放出来。但在糊化过程中，蛋白质对淀粉颗粒的保护作用减弱，使淀粉更容易破裂，在吸水膨胀后达到的最大体积减小，造成了峰值黏度的显著降低。

注： a.样品Ⅰ； b.样品Ⅱ； c.样品Ⅲ； d.样品Ⅳ； e.样品Ⅴ。

在糊化过程中，淀粉外层的蛋白质能够形成网络结构[23]，对于维持样品结构有重要作用，去掉淀粉颗粒外围的蛋白质后，样品热糊稳定性降低，淀粉糊的抗剪切能力降低，造成了衰减值的显著降低。蛋白质去除后，包围淀粉的蛋白减少，造成糊化时蛋白网络结构的减少，徐晶冰等[24]认为蛋白网络结构的减少使无序排列的淀粉分子更难回归有序，从而使回生值降低。但蛋白质的去除，可能破坏了淀粉表面的水化膜。水化膜的破坏使糊化更难进行[16]，造成峰值时间和糊化温度的增加。

2.4 核磁共振分析

糊化本质上是淀粉与水在加热状态下的反应[25]，通过研究样品与水的结合能力及样品持水能力，有利于研究蛋白影响糊化的机制，如姚远等[26]研究表明，提高淀粉的持水性，能改变淀粉分子附近的微区黏度以及淀粉的回生特性。通过NMR测定氢核的T2以及信号峰面积(A2)比例变化可以得知当去除蛋白组分后，样品的结合水能力和水分迁移的变化，用来解释糯米粉糊化时黏度以及糊化温度的变化。NMR的T2信号曲线中，前3个峰分别代表深层结合水、半结合水和自由水。深层结合水与蛋白、淀粉等紧密结合，在大米生产加工过程中不会发生迁移变化[27]；不同蛋白组分样品的核磁曲线如图4所示，它的横向弛豫时间、各峰信号面积比如表3所示。

由图4和表3可以看出，蛋白质组分的去除使样品的峰顶点时间T22、T23呈增加趋势，A22、A23呈减少趋势。通过表3可以看出，在样品去除球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白后，样品的T22分别增加1.62、5.63、1.21 ms，T23分别增加15.81、27.06、17.33 ms，A22减少了15.76%、98.44%、14.41%，A23减少了38.33%、55.41%、33.33%。分子流动性的氢核的T2与水分子的流动性成正比，T2越大，则代表该部分水分子流动性越强，该样品结合水能力越弱[28]，说明蛋白质的去除使样品更难与水结合，且样品中可以移动的半结合水和自由水的比例呈减少趋势。这些说明蛋白质组分对样品中结合水能力和水分分布有重要影响。

图4 样品核磁曲线

表3 核磁参数

由表4可知，随着蛋白组分的去除，T22、T23与峰值黏度、衰减值和回生值有相反趋势，与峰值时间和糊化温度有相同趋势，A22、A23与峰值黏度、衰减值和回生值有相同趋势，与峰值时间和糊化温度有相反趋势。这是因为在去蛋白之后样品与水结合能力降低，样品中自由水和半结合水比例显著降低。持水能力的显著降低，使淀粉更难开始糊化，并且淀粉在糊化膨胀过程的吸水能力减弱，造成了样品糊化过程黏度的减小[5]以及糊化温度的增加。球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白的去除都对样品的结合水能力及样品内自由水、结合水的比例有重要影响，从而影响糊化特性。

表4 糊化特性指标与核磁参数的相关性

2.5 傅里叶红外分析

傅里叶红外分析是研究淀粉结构及作用力变化的重要方法。有学者通过红外分析来研究淀粉的水分含量、糊化及回生特性[29-30]。淀粉属于多羟基聚合物，所以它的分子内以及分子间有很多氢键存在，这些氢键的主要作用是维持淀粉的网络结构[31]，而网络结构对淀粉的糊化特性有很大的影响[8, 32-33]。通过傅里叶红外光谱可以很好地检测到样品去蛋白之后，淀粉周围氢键强弱的变化。样品分子内或分子间氢键的形成都能够使参与合成氢键的原化学键力常数减少，使光谱上的吸收频率向着低波数方向移动[34]。波数在3 430 cm-1附近出现较宽的吸收峰表明为OH基，主要与淀粉分子内及分子间多个氢键有关[35]。图5和表5为分级去蛋白之后样品的傅里叶红外曲线及参数，峰值处波数用σ表示。

由图5可以看出，不同样品的光谱图基本一致，没有新峰的增加或减少，说明淀粉的结构没有变化。由表5可知，蛋白组分改变后，3 400 cm-1附近的吸收峰(σ6)的频率向着高波数的方向移动。

图5 傅里叶红外曲线

表5 红外光谱参数

由表6可知，σ6与样品峰值黏度、最低黏度、衰减值、最终黏度、回生值呈显著性负相关，与糊化温度、峰值时间呈显著性正相关。这是因为随着蛋白质的去除，蛋白-淀粉体系中维持网络结构的氢键减弱。结合电镜结果可知，大米淀粉是嵌入在蛋白结构中，在糊化时蛋白对淀粉有保护的作用，使淀粉在膨胀时更难破裂。淀粉-蛋白之间作用力的减弱，使得蛋白质对淀粉的保护作用降低，从而造成淀粉在膨胀过程更容易破裂，这是去蛋白之后淀粉糊化过程中黏度降低的主要原因。

表6 糊化特性指标与红外光谱参数的相关性

3 结论

与对照相比，随着蛋白组分的去除，样品黏度曲线变低、趋向平缓。去除谷蛋白、球蛋白和醇溶蛋白能够显著降低糯米粉的峰值黏度和衰减值，其中影响最大的是谷蛋白，其次是球蛋白，最后是醇溶蛋白，而清蛋白对糊化特性没有显著的影响。去除球蛋白能够显著降低样品的回生值，再去除谷蛋白或醇溶蛋白后对样品回生值影响不大。去除谷蛋白和球蛋白会使样品达到峰值黏度的时间显著增加。

去除球蛋白后，样品颗粒从蛋白包裹中析出，状态从大颗粒变成分散细小的颗粒；去除谷蛋白和醇溶蛋白后，样品颗粒从有棱角变得趋于平滑、圆润。蛋白去除后，淀粉周围的蛋白明显减少，使得样品中蛋白和淀粉体系的氢键变弱，蛋白对淀粉的作用力减弱，同时蛋白对淀粉在加热膨胀过程中的保护减弱，使淀粉更加容易破裂，膨润力降低，峰值黏度变低；淀粉外层的蛋白减少使得样品糊化时抗剪切能力降低，并使淀粉糊老化得到延缓。去除球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白造成淀粉持水能力的显著降低，淀粉更难开始糊化，并且淀粉在加热膨胀过程的吸水能力减弱，造成了样品糊化温度的增加和黏度曲线的整体变低。

通过去除蛋白组分的方法研究蛋白对糊化特性的影响，能够得到自然结合状态下糯米粉中各种类蛋白对糊化特性的影响及作用，可以通过去除某组分蛋白改变糊化特性，进而改变糯米粉的加工特性，具有重要的实践意义。同时能为糯米粉品种的筛选、培育，以及糯米粉加工品质的提高提供理论依据。本研究是通过溶解度对蛋白进行分类的，蛋白质在分子层面以及结构方面上对糊化特性的影响机制还有待进一步研究。并且，因糯米粉中每种蛋白的含量很难控制，所以本研究是自然状态下通过去除某组分蛋白来改变样品中蛋白组分，但是每种蛋白的含量对糊化特性的影响也有待进一步研究。