苏晓燕，韩步鹰，孟玉琼，白晓易，李长忠，马 睿

( 1.青海大学 生态环境工程学院，青海 西宁 810016； 2.省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810016 )

虹鳟(Oncorhynchusmykiss)属鲑形目、鲑科，是一种养殖范围较广的冷水性鱼类[1]。青海省处三江源低氧高海拔地区，水资源丰富，水质纯净，主要以三倍体虹鳟养殖为主[2]，三倍体虹鳟特殊性在于性腺不发育，具有生长快、周期短、肉质好、高产、高效、市场广阔等特点，被广泛养殖[3]。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是检测基因表达的重要方法[4]，操作灵敏、特异性强、定量准确、检验范围广，广泛应用于多个领域[5-6]。使用荧光定量对某一目的基因在不同组织中表达量进行比较时，提取不同组织中RNA浓度的不同、反转录为cDNA效率不同等因素会影响实时荧光定量PCR结果的准确性[7-12]，通常需选择合适的内参基因对存在的误差进行校准，选择适宜的内参基因或组合是精确计算目的基因表达水平且进行基因功能研究的关键[13-17]。理想的内参基因应该在不同组织中稳定表达[18-19]，但绝对理想的内参基因是不存在的，任何一种内参基因的稳定表达都是相对的[20]。吴萍等[21]研究发现，翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)成鱼不同组织中18S rRNA和GAPDH基因的平均稳定值最低，相对表达量最稳定；Ma等[22]研究发现，虹鳟不同组织中，β-actin基因平均稳定值最低，在虹鳟皮肤中稳定表达； Reveco等[23]的研究表明，虹鳟在低氧应激影响及投喂大豆替代饲料与正常饲养对比下，rpl8与ef1-α基因在虹鳟后肠中稳定表达；Olsvik等[24]对大西洋鲑(Salmosalar)8种组织6个内参基因稳定性的研究显示，ef1-αA基因在肝脏、肌肉、鳃、头肾、脾脏、胸腺中表达最稳定，ef1-αB和β-actin基因在脑和肠中表达最稳定。内参基因的表达情况并非具有一致性[25]，因此在进行三倍体虹鳟不同组织某种目的基因的表达水平变化研究时，选择一个或多个内参基因作为参考尤为重要。

基因表达分析时常用的内参基因主要包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gapdh)、核糖体大亚基蛋白基因(rplp2)、真核延伸因子基因(ef1-α)、β-肌动蛋白基因(β-actin)、18S核糖体RNA(18S rRNA)等。甘油醛-3-磷酸脱氢酶是一种典型的糖酵解酶，是一种广泛存在于各组织细胞中的多功能蛋白[26]；核糖体大亚基蛋白是细胞内核糖体的主要构成成分之一，属于核糖体蛋白[27]；真核延伸因子是一种构建核苷酸序列的启动子，具有调控肌动蛋白组装微丝的功能[28]；β-肌动蛋白是细胞中的一种重要骨架蛋白[29]；18S rRNA是真核生物体内含量最多的核糖体RNA[30]。以上基因几乎在所有组织中高水平表达，在相同的组织或细胞中蛋白质表达量一般是恒定的，被广泛用作标准化内参基因。

内参基因的稳定性直接关系到定量PCR分析的稳定可靠性。在实时荧光定量PCR中，目前广泛使用的内参基因筛选软件有GeNorm软件、NormFinder软件、Best-Keeper软件等。GeNorm软件通过计算每个内参基因平均表达稳定值(M)，筛选出稳定性好的内参基因[31]；NormFinder软件计算原理与GeNorm相似，通过计算内参基因表达稳定值，筛选最适内参基因，表达稳定值越小的内参基因为最适内参基因[32]；Best-Keeper软件是针对内参基因和目的基因表达量分析的程序[33]。

笔者以三倍体虹鳟不同组织为试验材料，利用实时荧光定量PCR技术分析β-actin、ef1-α、18S rRNA、gapdh和rplp2 5个内参基因在三倍体虹鳟不同组织中的表达水平，通过Best-Keeper、NormFinder、GeNorm软件分析5个候选内参基因的表达稳定性，选出适当的内参基因，以期为三倍体虹鳟的基因表达研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验用三倍体虹鳟取自青海省海南州龙羊峡三倍体虹鳟养殖基地，选择体质量约800 g的三倍体虹鳟6尾，用丁香酚(1∶10000)麻醉后，采用尾静脉采血法抽取血液，之后剖取脑、眼、鳃、皮肤、心脏、肾脏(头肾、中肾、后肾)、肝脏、脾脏、胃、幽门垂、肠(前肠、中肠、后肠)以及肌肉(红肌、白肌、肌间隔)。采集的19个组织样品迅速在液氮中速冻后置于-80 ℃保存。

1.2 总RNA的提取和cDNA的合成

参照总RNA提取试剂盒(TAKARA，中国)说明书提取剖取的三倍体虹鳟不同组织总RNA，提取结束后，利用超微量核酸蛋白测定仪(IMPLEN，德国)和1%凝胶电泳对RNA的质量和浓度进行检测，检测合格后，参照反转录试剂盒(TAKARA，中国)说明书对总RNA进行反转录，合成的cDNA于-20 ℃下保存备用。

1.3 候选内参基因引物设计与合成

本试验选择5个内参基因作为三倍体虹鳟候选内参基因，根据鱼类同源基因序列设计实时荧光定量PCR引物，筛选可扩增出特异DNA片段的基因引物进行后续的候选内参基因稳定性分析。筛选的5个候选内参基因分别为β-actin、ef1-α、gapdh、rplp2和18S rRNA(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 候选内参基因引物序列Tab.1 Primer information on candidate genes

1.4 三倍体虹鳟候选内参基因实时荧光定量PCR反应产物的特异性检测

根据文献[34]的方法测定，分别将三倍体虹鳟各组织cDNA混合液(稀释5倍)作为模板，对候选内参基因引物进行特异性检测分析，PCR反应体系：双蒸水7 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(TAKARA，中国)10 μL，cDNA 1 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.5 三倍体虹鳟候选内参基因实时荧光定量PCR基因扩增

将不同组织的cDNA稀释5倍作为模板，用实时荧光定量PCR仪(Light Cycler 384， ROCHE，瑞士)对所有候选内参基因进行实时荧光定量PCR扩增，每个样品重复3次。反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(TAKARA，中国)5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，双蒸水3.4 μL，cDNA 1 μL。反应程序：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 s，50次循环；于70～95 ℃收集熔解曲线荧光信号。

1.6 数据分析

用GeNorm、NormFinder、Best-Keeper分析各候选内参基因在三倍体虹鳟不同组织中表达稳定性。

2 结果与分析

2.1 样品RNA检测

对提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳(图1)，28S和18S条带清晰，部分5S条带隐约可见，完整性良好。超微量核酸蛋白测定仪测定所有待测样品RNA质量浓度在200～1000 ng/μL间，吸光度1.8～2.0，满足后续试验需求。

图1 三倍体虹鳟19种组织总RNA琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from 19 tissues of triploid rainbow troutM.DNA标记DL 2000； 1.脑； 2.眼睛； 3.鳃； 4.皮肤； 5.心脏； 6.头肾； 7.中肾； 8.后肾； 9.肝脏； 10.脾脏； 11.胃； 12.幽门垂； 13.前肠； 14.中肠； 15.后肠； 16.红肌； 17.白肌； 18.肌间隔； 19.血液.M.DL 2000 DNA marker; 1.brain; 2.eye; 3.gill; 4.skin; 5.heart; 6.head kidney; 7.middle kidney; 8.metanephros; 9.liver; 10.spleen; 11.stomach; 12.pylorus; 13.fore-gut; 14.mid-gut; 15.hindgut; 16.red muscle; 17.white muscle; 18.inter-muscular septum; 19.blood.

2.2 内参基因引物特异性熔解曲线分析

将5个候选内参基因的引物进行实时荧光定量PCR扩增和熔解曲线分析(图2)。由图2可见，熔解曲线呈现单峰，说明扩增产物单一，没有引物二聚体，引物特异性较好，熔解曲线能准确地反映目的基因扩增结果的变化，避免出现假阳性结果。

图2 候选内参基因溶解曲线Fig.2 Melting curve of candidate reference genes

2.3 实时荧光定量PCR Ct值比较

在实时荧光定量PCR反应中，不同基因在对应的组织中表达丰度与Ct值的大小成反比，即Ct值越大，该基因在对应的组织中表达丰度就越低；反之，表达丰度就越高。rplp2基因Ct平均值最大，为26.33；其次为gapdh基因，在各个组织中Ct平均值为25.34；ef1-α基因在各个组织中Ct平均值为20.15；β-actin基因各个组织中Ct平均值为17.97；18S rRNA在各个组织中Ct平均值最小，为16.68(图3)。试验结果表明，5个候选内参基因在三倍体虹鳟的不同组织中表达量不同。

图3 候选内参基因在不同组织中的Ct值比较Fig.3 Ct value comparison of all candidate reference genes in different tissuesB.脑； E.眼睛； G.鳃； SK.皮肤； H.心脏； HK.头肾； Me.中肾； Met.后肾； L.肝脏； S.脾脏； ST.胃； P.幽门垂； F.前肠； MI.中肠； HI.后肠； RM.红肌； WM.白肌； IS.肌间隔； BL.血液.B.brain; E.eye; G.gill; SK.skin; H.heart; HK.head kidney; Me.mesonephros; Met.metanephros; L.liver; S.spleen; ST.stomach; P.pyloric caeca; F.fore-gut; MI.mid-gut; HI.hind-gut; RM.red muscle; WM.white muscle; IS.inter-muscular septum; BL.blood.

2.4 GeNorm软件分析结果

GeNorm软件计算候选内参基因在三倍体虹鳟不同组织中的平均表达稳定值M(图4)和配对差异值V(图5)，5个候选内参基因的M值依次为rplp2=β-actinef1-α>18S rRNA>gapdh。通过配对差异值(Vn/Vn+1)确定内参基因数，n值为所需内参基因的最佳数目，由图5可见，V2/V3值最小，最适内参基因数目为2。综合M和Vn/Vn+1值，rplp2和β-actin是表达最稳定的内参基因。

图4 GeNorm分析候选内参基因的平均表达稳定值Fig.4 Average expression stability value of candidate reference genes analyzed by GeNorm software

图5 GeNorm程序分析最适内参基因数目Fig.5 Analysis of the optimal number of the reference genes using GeNorm software

2.5 NormFinder软件分析结果

NormFinder软件计算候选内参基因在三倍体虹鳟不同组织的平均表达稳定值(图6)，5个候选内参基因的稳定值依次为rplp2=β-actinef1-α>18S rRNA>gapdh。

图6 NormFinder分析候选内参基因表达稳定值Fig.6 Average expression stability value of candidate reference genes analyzed by NormFinder software

2.6 Best-Keeper软件分析结果

Best-Keeper可以计算每个内参基因的相关系数(r)、标准偏差和变异系数。通过比较各值的大小，确定内参基因的稳定性(表2)。

表2 Best-Keeper对候选内参基因统计分析Tab.2 Descriptive statistics of the candidate reference genes using Best-Keeper software

由表2可见，5个候选内参基因的标准偏差依次为rplp21时，则该内参基因表达不稳定。根据Best-Keeper判定原则，对标准偏差和变异系数综合分析表明，rplp2基因稳定性最佳。

3 讨 论

3.1 候选内参基因的表达稳定性分析

本研究中，所有引物的扩增效率和扩增特异性均较好，表明实时荧光定量PCR具有很高的质量和好的引物特异性，利用实时荧光定量PCR分析5个候选内参基因在三倍体虹鳟不同组织中表达情况，且通过NormFinder、GeNorm、Best-Keeper软件对5个候选内参基因的表达稳定性进行分析。GeNorm软件是专门用于实时荧光定量PCR中筛选内参基因及确定最适内参基因数目的程序，最终选择两个或两个以上合适的内参基因来校正数据，GeNorm是通过计算每个基因稳定性的M值来筛选稳定性好的内参基因，计算出的M值与内参基因的稳定性成负相关，通过计算内参基因标准化因子的配对变异V值，根据Vn/Vn+1的比值确定最适内参基因的数目，n值为所需内参基因的最佳数目，本研究中，结合GeNorm软件分析所得M值与V值，最终得出最适内参基因为β-actin和rplp2。NormFinder是另一种筛选最适稳定性内参基因的软件，其判定标准与GeNorm相同，根据M值大小判定内参基因的稳定性，本研究中NormFinder分析最终得出最适内参基因为rplp2与β-actin。Best-Keeper是针对内参基因和内参基因表达分析的程序，可以计算每个基因之间产生配对的相关系数r，标准偏差与变异系数，通过比较各个值的大小最终确定稳定性较好的内参基因，判定标准为相关系数越大，标准偏差和相关系数越小，内参基因稳定性越好；反之，内参基因稳定性越差。当标准偏差>1时，该内参基因越不稳定[35]。本研究中经Best-Keeper软件分析得出rplp2稳定性最好。本研究中Best-Keeper最终分析结果与GeNorm和NormFinder分析结果不同，原因是Best-Keeper软件是直接通过Ct值进行配对相关分析，依赖于反应原始数据，对候选内参基因的稳定性排序没有GeNorm软件和NormFinder软件有效，一般用其对候选内参基因进行初步筛选[36]。

3.2 不同组织内参基因稳定性分析

根据3种软件统计分析得出rplp2与β-actin内参基因在三倍体虹鳟各组织中表达最稳定。类似的结果在其他鱼类的研究中也有报道，茅华华等[37]研究发现，斑鳢(Channamaculata)成鱼不同组织中β-actin基因最稳定；费越越等[38]研究发现，健康异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)不同组织中，ef1-α与β-actin基因表达最稳定；董捷等[39]研究发现，草鱼(Ctenopharyngodonidella)不同组织中，β-actin基因与18S rRNA表达最稳定；McCurley等[40]研究发现，斑马鱼(Daniorerio)不同组织中，18S rRNA、rpl-13α和ef1-α基因表达最稳定；Ingerslev等[41]对大西洋鲑的研究发现，3种常见内参基因β-actin、ef1-α、RPS20，在不同组织中表达均有变化，其中ef1-α相对稳定可以作为内参基因；武梦斌等[42]研究发现，在达氏鲟(Acipenserdabryanus)成鱼不同组织中ef1-α表达最稳定，不同发育卵巢中rpl8表达最稳定；孙海成等[43]研究发现，尖裸鲤(Oxygymnocyprisstewarti)不同组织中rpl13基因表达最稳定；Ma等[44]研究发现，许氏平鲉(Sebastodsschlegelii)不同组织中rpl17为稳定的内参基因；在鳜鱼(Sinipercachuatsi)、大西洋鲑和普通二倍体虹鳟的研究中，β-actin为稳定的内参基因[24,45-46]。说明内参基因在不同的物种之间表达存在差异。

3.3 不同试验条件候选内参基因稳定性分析

另外，研究结果表明，在不同的组织、细胞、细胞增殖和器官发育所处的不同阶段、体外培养、各种试验条件等情况下内参基因表达的稳定性不同。大西洋鲑中内参基因ef1-f稳定性最好，gapdh稳定性最差[26,41,47]；在斑马鱼[40,48]的研究中发现，在不同生长阶段和不同组织中，ef1-α和βf1-α是稳定表达的内参基因，而且发现在不同性别的试验动物中，内参基因表达也不同；Shekh等[46]研究发现，β-actin在虹鳟皮肤中是最稳定表达的内参基因；Ma等[22]发现，虹鳟在热应激下，β-actin和ef1-f分别是肝脏和头肾中表达最稳定的内参基因。总之，不同试验对象以及不同的试验处理对内参基因的选择有很大的影响，因此，内参基因表达的稳定性分析对于研究目的基因的表达具有重要意义。

3.4 多内参基因表达稳定性分析

一些试验对基因表达定量准确度有较高的要求，单个内参基因无法很好地起到校准作用，需要两个及以上的表达量稳定的内参基因进行校准[49]。在大西洋鲑8种不同组织中，6种内参基因的表达稳定性依次为ef1-αB(0.42)>ef1-αA(0.43)>β-actin(0.48)> rps20(0.5)>18S rRNA(0.56)>gapdh(0.6)，研究者建议使用ef1-αB与ef1-αA作为内参基因[24]；斑马鱼的8种候选内参基因分析结果显示，tuba1、β-actin、ef1-α的稳定性较高，建议可以在斑马鱼用作内参基因[40]；蓝点马鲛(Scomberomorusniphonius)11种不同组织中4种内参基因稳定性排序为ef1-α(0.393)>18S rRNA(0.406)>β-actin(0.44)>gapdh(0.630)[50]；健康异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)8个不同组织中4种内参基因表达稳定性依次为β-actin(0.404)=ef1-α(0.404)>18S rRNA(1.501)>gapdh(1.885)，建议使用β-actin与ef1-α作为适宜内参基因[38]；卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)8个不同组织中8个内参基因稳定性排序为18S rRNA=B2M(1.2)>rpl13(1.8)>UBCE(2)>β-actin(2.4)>ef1-α(2.6)>gapdh(2.8)>TTLL1(3.0)，建议使用18S rRNA与B2M作为内参基因[51]。而本研究中，5个候选内参基因在三倍体虹鳟19个不同组织中rplp2与β-actin最稳定，建议作为三倍体虹鳟不同组织中的内参基因，与上述研究部分相似，均选取两个基因作为适宜的内参基因，是因为双内参组合能更加准确地分析目的基因在不同组织的相对表达量，可以确保目的基因相对表达结果的可靠性，并且采用双内参基因组合，可以提高试验结果的精确度。

4 结 论

通过实时荧光定量PCR技术结合3种稳定性分析软件GeNorm、NormFinder、Best-Keeper对5个候选内参基因稳定性进行评价，结果显示，rplp2与β-actin在三倍体虹鳟不同组织中表达较为稳定，同时使用两个内参基因作为研究三倍体虹鳟基因表达水平的内参基因，可提高结果的准确度，从而最大限度反映目的基因真实的表达水平，为后续三倍体虹鳟相关基因的定量表达分析提供参考依据。