何亮银，周逢芳，史晓丽，黄伟卿，阮俊峰，田文贞，李进寿

( 宁德师范学院 生命科学学院，福建 宁德 352100 )

大黄鱼(Larimichthyscrocea)是我国重要海水经济鱼类，主要分布于东海和黄海南部，以及南海雷州半岛东侧近海水域[1]。据中国渔业统计年鉴，2019年大黄鱼养殖产量为225 549 t，已连续多年位居我国海水养殖鱼类之首[2]。近年来，由于大黄鱼网箱养殖密度过高，水体流通不畅，导致水体环境日益恶劣，病害严重，较易多发的有刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans)病、水霉病、内脏白点病、肠炎病、烂尾病及弧菌病等，造成大黄鱼养殖业严重的经济损失[3]。有效控制各种病原感染已成为大黄鱼养殖产业健康可持续发展的迫切要求，通过水产病原疫苗防治病害被广泛认为是一种绿色健康、安全有效的可行途径[4]。一种疫苗研制的方法是将灭活的病原菌按标准免疫流程注射到小鼠、家兔等试验动物体内，免疫周期结束后获取抗血清，以免疫印迹结合串联质谱鉴定免疫原性蛋白，并进一步开发为亚单位疫苗或基因工程疫苗[5]。笔者通过对引起宁德三都澳海域网箱养殖大黄鱼患病的病原进行分离、鉴定，明确病原的形态特征、培养特性、理化性质及16S rDNA序列信息，为病原菌的生物学特性研究提供基础数据；通过制备病原菌的鼠源多克隆抗体，为病原菌的免疫原性分析及后续免疫防治打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

濒死患病10月龄大黄鱼取自宁德三都澳海域养殖网箱，发病水温约25 ℃。感染初期，病鱼不摄食，体色变暗；感染后期，病鱼头部及腹部有出血点，腹部微肿胀，逐渐死亡。用于人工感染试验的健康大黄鱼购自宁德富发水产有限公司，体长(15.0±1.5) cm，体质量(46.4±3.5) g。用于多克隆抗体制备的Balb/c小鼠购自吴氏试验动物公司。

1.2 主要试剂与仪器

用于病原菌分离与培养的LB肉汤、LB琼脂培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，DNA聚合酶等分子生物学相关试剂购于宝生物工程(大连)有限公司，用于病原菌生理生化特性分析的VITEK细菌鉴定卡购于法国梅里埃公司。

试验主要仪器设备：超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、核酸电泳系统(北京六一生物科技有限公司)、PCR仪(美国伯乐公司)、全自动细菌鉴定仪(法国梅里埃公司)、全波长扫描式多功能酶标仪(美国热电公司)。

1.3 优势菌株的分离

选取患病濒死大黄鱼，用75%乙醇棉球对病鱼体表进行擦拭消毒，无菌条件下解剖，可见病鱼有轻微腹水，肝脏肿大，颜色较深，肠道轻度充血。挑取肝脏组织划线接种于LB琼脂上，28 ℃恒温培养24 h后发现，平板上生长的菌落形态较为一致，挑取若干个优势菌株进行重复划线分离纯化3次，得到多株纯化菌株，选取其中1株，定名为NDLc-P。

1.4 优势菌回归感染

选取体质量(46.4±3.5) g的健康大黄鱼用于回归感染试验，试验前暂养7 d，养殖水温为(25±1) ℃，每日换水1/3，持续充氧，隔日投喂饲料。优势菌NDLc-P接种于LB肉汤，28 ℃恒温摇床培养24 h后，8500 r/min(离心半径587 mm，下同)离心5 min收集菌体，菌体经无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)离心洗涤3次后，麦氏比浊仪调整密度为1.0×109cfu/mL，然后按10倍稀释分别获得1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103cfu/mL共7个试验密度。试验用鱼共分8组，每组10尾，其中7组分别经腹腔注射上述密度菌悬液0.2 mL，对照组注射等体积的无菌PBS。攻毒后10 d内连续观察并记录鱼体的发病与死亡情况。同时，随机对死亡大黄鱼及时剖检，并进行致病菌的再次分离与鉴定。

1.5 优势菌株的形态学观察与生理生化特性分析

取LB琼脂上分离培养的优势菌，革兰氏染色后在光学显微镜下观察细菌形态特征。采用法国梅里埃(BioMerieux)公司的微量多项鉴定系统对病原菌生理生化特性进行分析。挑取LB琼脂上分离的优势菌，以生理盐水配制成0.50～0.63麦氏浊度的菌悬液，按照操作要求进行系统装载和数据读取与分析。

1.6 优势菌16S rDNA基因序列分析

挑取分离纯化的病原菌预混于无菌去离子水中，作为PCR反应模板。参考文献[6]合成细菌16S rDNA基因扩增通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。设置PCR反应条件为：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。反应完毕取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物经试剂盒回收浓缩，连接至pMD19-T克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞及菌落PCR筛选阳性克隆后送福州博尚(尚辰)生物技术有限公司测序，将测定的16S rDNA序列通过美国国立生物技术信息中心的Blast检索系统(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)进行同源性比对分析，并从比对结果中选取其他相似度较高的菌株序列，使用Clustal X 2.0软件进行多序列比对，MEGA 5.0进行系统发育分析，采用邻位相连法构建系统进化树。

1.7 优势菌鼠源多克隆抗体的制备

挑取LB琼脂上分离的优势菌，接种至LB肉汤28 ℃培养24 h后，8500 r/min离心5 min收集菌体，无菌PBS洗涤3次，调整菌液密度为5×108cfu/mL后，加入终体积分数为0.5%的甲醛在4 ℃条件下振荡灭活4 h，灭活菌体经无菌PBS洗涤5次后再调整密度为5×108cfu/mL，取0.2 mL灭活菌液在无菌环境下涂布于LB肉汤琼脂培养基28 ℃培养24 h，以验证菌体已被灭活。已经灭活后的菌悬液4 ℃保存备用。

灭活优势菌NDLc-P分4次免疫2只8～12周龄的Balb/c小鼠，具体免疫程序如下：基础免疫，灭活菌悬液与弗氏完全佐剂1∶1(体积比)混匀至“油包水”状态后，腹腔注射0.2 mL；2周后进行第1次加强免疫，灭活细菌悬液与弗氏不完全佐剂1∶1(体积比)腹腔注射0.2 mL；第4周和第5周分别再加强免疫1次，尾静脉注射不加佐剂的菌悬液0.2 mL；最后一次加强免疫后1周摘眼球一次性取血，全血室温倾斜放置2 h后置于4 ℃过夜，次日3000 r/min、4 ℃离心10 min获抗血清，后续试验将2只小鼠的抗血清混合使用。

1.8 鼠抗血清抗体特性分析

以0.05 mol/L PBS将灭活优势菌NDLc-P密度调整至1×108cfu/mL，按每孔100 μL加入96孔酶标版，设置3个平行，4 ℃包被过夜；次日倾去包被液，含0.5%吐温20的磷酸缓冲盐溶液(PBST)洗涤3次后，加入含5%脱脂奶粉的PBST，37 ℃孵育1 h；PBST洗涤3次后，每孔加入PBST稀释成不同密度梯度的鼠抗血清100 μL，37 ℃孵育1 h；按上述步骤洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(sigma,1∶5000)100 μL，37 ℃孵育50 min；洗涤后加入TMB显色液(碧云天)显色至预期深浅后加入2 mol/L H2SO4终止显色，酶标仪在450 nm测量反应液吸光值。判定P/N≥2.1时为阳性。

2 结果与分析

2.1 病症观察与优势菌的菌落特性

患病大黄鱼体色变暗，眼睛、体表及胸鳍基部出血(图1a)；解剖可见少量腹水，肠壁充血发炎，肠道充满黄色黏液(图1b)。光学显微镜下，优势菌为短杆状，革兰氏染色呈阴性。优势菌在LB平板上28 ℃培养24 h后生长良好，肉眼可见白色菌落，中央略凸起、边缘较光滑、呈圆形。

图1 患病大黄鱼Fig.1 Symptoms of diseased large yellow croaker L. croceaa.眼睛、头部及胸鳍基部出血；b.肠道充满黄色黏液.a.bleeding from the eyes, head and pectoral fin base；b.the intestines are filled with yellow mucus.

2.2 优势菌的回归感染及致病力分析

分离优势菌NDLc-P经腹腔注射感染大黄鱼后，高密度组(1.0×109、1.0×108、1.0×107cfu/mL注射组)试验鱼在4～5 d开始出现死亡，在8～9 d累积死亡率达100%；中密度组(1.0×106、1.0×105cfu/mL注射组)试验鱼开始出现死亡的时间推迟，且至试验结束时死亡率小于50%；低密度组(1.0×104、1.0×103cfu/mL注射组)无试验鱼死亡(图2)。死亡个体出现的症状与自然发病鱼体相吻合，且从随机挑选的发病大黄鱼病灶处可再次分离得到大量细菌，各个菌落形态一致，与菌株NDLc-P相似，而对照组鱼体未表现任何症状。对分离病原菌进行16S rDNA基因序列分析，序列信息与NDLc-P完全一致，表明试验分离得到的优势菌即为大黄鱼的致病菌。根据感染试验获得的各密度组累积死亡率数据，按照改进的寇氏法[7]，计算病原菌NDLc-P感染后7 d对体质量(46.4±3.5) g的健康大黄鱼的半数致死密度为3.98×107cfu/mL，表明该病原菌具有一定的致病力。

图2 不同密度优势菌腹腔注射回归感染大黄鱼试验结果Fig.2 Artificial challenge of large yellow croaker L. crocea against various densities of the isolated strain NDLc-P

2.3 病原菌的生理生化特性分析

生理生化反应显示，菌株NDLc-P的β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、脂肪酶及酪氨酸芳胺酶等反应呈阳性；能利用D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-甘露糖及D-甘露醇等，不能利用古老糖、D-塔格糖及D-山梨醇等，能生成H2S(表1)。根据测试的生理生化特性，VITEK 2 COMPACT系统鉴定病原菌为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)，且置信度为“极好的鉴定”，正确概率达98%。

表1 病原菌的生理生化特性Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of the isolated pathogenic strain

2.4 16S rDNA基因序列分析及病原菌系统发育树构建

直接以病原菌为模板，采用27F和1492R引物对进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析，目的片段单一、明亮，大小符合预期(图3，泳道1)。PCR扩增产物经T-A克隆后测序，碱基序列经美国国立生物技术信息中心在线工具Nucleotide BLAST同源比对分析，该序列同嗜水气单胞菌M_13(登录号MG428903.1和H_23(MG428896.1)的16S rDNA基因序列同源性达99.87%。选取数据库中与菌株NDLc-P的16S rDNA序列高度同源的其他14株单胞菌利用邻位相连法构建系统发育树，结果显示，菌株NDLc-P与嗜水气单胞菌聚为一支，置信度为84%(图4)。根据菌株NDLc-P的16S rDNA序列同源比对与系统进化树构建结果，将其鉴定为嗜水气单胞菌。

图3 琼脂糖凝胶电泳分析病原菌16S rDNA基因的PCR扩增产物Fig.3 The agarose gel electrophoresis of gene amplification of 16S rDNA of the isolated strainM.DL 2000 marker；1.16S rDNA基因.M.DL 2000 marker；1.16S rDNA gene.

图4 基于16S rDNA序列的菌株NDLc-P系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain NDLc-P based on 16S rDNA sequences

2.5 病原菌鼠源多克隆抗体效价测定

酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结果显示，随着鼠源抗血清稀释倍数增加，P/N值逐渐降低，当稀释倍数小于40 000时，P/N>2.1，而当稀释倍数大于50 000时，P/N<2.1，表明试验制备的抗血清效价较高，达40 000(图5)。

图5 间接ELISA测定鼠抗血清效价Fig.5 Detection of the titers of mouse antisera against strain NDLc-P

3 讨 论

3.1 水产病原的分离鉴定

病原的分离与鉴定是病原致病机理研究与病害防治的首要任务。微生物的种类不同，生命活动与新陈代谢也不尽相同，利用微生物的代谢特征鉴定微生物种类是经典方法之一。由于16S rDNA基因分子结构上的高度保守性、分布的普遍性及其所含的大量信息，使其成为一个较为理想的基因分类靶序列，被广泛应用于细菌鉴定中[8]。目前，在病原菌鉴定方面，研究人员广泛采用结合形态特征、生理生化反应及16S rDNA序列等信息的方法，综合判断病原种类。沈锦玉等[9]通过16S rDNA分子鉴定了大黄鱼低温弧菌病病原为溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)；李忠琴等[10]通过对大黄鱼分离菌的生理生化鉴定和扩增其16S rDNA基因序列鉴定其为维氏气单胞菌(A.veronii)；曹际等[11]通过对分离自患溃疡病大黄鱼肝脏中病原菌的生理生化特性及16S rDNA基因分析，鉴定病原为溶藻弧菌。本试验中，在对分离优势菌进行回归感染验证后，利用梅里埃全自动微生物鉴定系统对病原菌的生理生化特性进行了分析，系统判断其为嗜水气单胞菌，且正确概率达98%；对病原菌的16S rDNA基因序列进行比对分析，与数据库中嗜水气单胞菌的同源性达99.87%，基于16S rDNA的病原菌进化树也显示病原菌与嗜水气单胞菌聚为一支。综合病原菌的生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，确定NDLc-P为嗜水气单胞菌。

3.2 嗜水气单胞菌引起水产动物病害

嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体中，是多种水生动物的原发性致病菌，也是一种条件致病菌，是典型的人—兽—鱼共患病病原菌[12-13]。该菌能引起软体动物、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳类等多种动物全身性败血症或局部感染，并常致动物死亡；引起人类急性胃肠炎、败血症及伤口感染[14]。嗜水气单胞菌能引起多种水产养殖动物病害，如锦鲤(Cyprinuscarpio)[15]、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[16]、青鱼(Mylopharyngodpiceus)[17]、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[18]等，也有报道发现嗜水气单胞菌能感染大黄鱼，引起体表和内脏出血，导致鱼体死亡[19-20]。笔者从患病网箱养殖大黄鱼内脏组织分离到嗜水气单胞菌NDLc-P，大黄鱼回归感染试验显示，其半致死密度为3.98×107cfu/mL，表明该病原株对养殖大黄鱼具有一定的致病力。

3.3 利用多克隆抗体诊断和防治水产病害

嗜水气单胞菌不仅能导致多数水产养殖动物病害发生，还被国外列入人体腹泻病原菌检测范围[21]。多克隆抗体被广泛应用于病原菌诊断检测和免疫防治。窦勇等[22]通过制备兔抗副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的多克隆抗体，为快速检测水产品中的副溶血弧菌奠定基础。李华等[23]通过免疫学方法制备了兔抗鲇爱德华菌(Edwardsiellaictaluri)的多克隆抗体，对其特性进行分析，并以此为工具建立该病原菌的快速、灵敏的免疫学检测方法。王雪妹[24]通过制备鳗弧菌(V.anguillarum)特异性多克隆抗体，为免疫保护性抗原的筛选及其研制疫苗防治鳗弧菌感染打下基础。Li等[5]也通过制备副溶血弧菌的鼠源抗血清，结合免疫印迹和质谱技术鉴定到多个免疫原性蛋白，其中VP0802对小鼠的免疫保护率达66.7%，可作为潜在候选疫苗。本试验制备了嗜水气单胞菌的鼠源多克隆抗体，酶联免疫吸附试验测定其效价达40 000，具有良好的结合病原菌活性，可应用于嗜水气单胞菌的检测和免疫防治。

4 结 论

自患肠炎病及有体表出血症状的大黄鱼肝脏组织中分离到1株优势菌NDLc-P，经人工回归感染试验确定其为致病菌，结合病原菌的生理生化特性及16S rDNA序列分析，综合判定其为嗜水气单胞菌，研究还制备了具有良好结合特性的鼠源多克隆抗体，后续将应用于大黄鱼嗜水气单胞菌病的免疫诊断及防治。