赵述傲， 朱仪章， 濮雨凌， 李子千， 杜逸之， 陈 可， 张潇月， 杨红宁， 顾文华， 丁梦媛，刘江锡， 杨婉婷， 周 翔， 燕宪亮

急性心肌梗死(AMI)是心血管系统疾病中的急危重症，发生率逐年增高，是世界范围内常见的死亡原因之一[1]。恢复心肌再灌注可加重心肌损伤、心功能障碍，诱发心肌细胞凋亡、死亡和心律失常，这种现象称为心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury， MIRI)[2]。近期研究[3]发现，MIRI中的细胞死亡除了有凋亡、坏死、自噬性细胞死亡外，还有另外一种死亡方式——铁死亡(Ferroptosis)。Ferroptosis是一种铁离子依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型程序性细胞死亡形式，Ferroptosis导致线粒体变小，膜密度增高，嵴减少或消失，外膜破碎等细胞线粒体形态改变[4]。本实验采用体外培养的大鼠心肌细胞糖氧剥夺/复灌(OGD/R)模型来研究MIRI后是否存在Ferroptosis并研究其作用。

1 材料与方法

1.1材料 H9c2细胞(中国科学院上海生命科学院分院)；铁死亡激动剂(Erastin)、铁死亡特异性抑制剂(Ferrostatin-1，Fer-1陶素药业有限公司)； CCK-8试剂盒(VICMED公司)；细胞培养相关试剂(Hyclone公司)。

1.2方法

1.2.1 细胞培养 将H9c2细胞用含有10%胎牛血清的L-DMEM重悬，于37 ℃、5% CO2培养。24 h后换液，弃未贴壁细胞，待细胞达80%～90%融合时，以0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2传代，达到基本融合后再次消化传代，进行扩增和富集。

1.2.2 分组及药物浓度 离体培养大鼠H9c2心肌细胞系。实验随机分为正常培养组(Control组)、铁死亡激动剂组(Erastin组)、氧糖剥夺/复灌组(OGD/R组)、溶剂对照组(OGD/R+DMSO组)和Ferroptosis抑制剂组(OGD/R+Fer-1组)。铁死亡抑制剂Fer-1浓度为0.5 μmol/L，作用时间为16 h；铁死亡激动剂Erastin的浓度为10 μmol/L，作用时间为24 h。Ferroptosis抑制剂组在OGD/R模型后加入含有Fer-1(0.5 μmol/L)的20%FBS培养液进行复灌12 h。溶剂对照组在制备OGD 模型后加入含有与抑制剂组同浓度的二甲基亚砜(DMSO)+20% FBS培养液进行复灌12 h。铁死亡激动剂单予以含有Erastin(10 μmol/L)+10% FBS培养液培养24 h。

1.2.3 OGD模型建立 预先调设三气培养箱至缺氧状态(37 ℃，1%O2，5%CO2，94%N2)。取培养12 h的H9c2心肌细胞，吸出培养液，加入无糖DMEM培养基，置于三气培养箱箱内培养。通过在不同缺氧时间和不同复灌时间条件下，观察H9c2细胞活力来确定造模最佳时间，根据预实验结果采用OGD模型放入三气培养箱中培养8 h，至观察时间点将细胞取出，换回含有20%FBS的培养液，置于普通培养箱复灌16 h后观察检测模拟MIRI模型。

1.2.4 CCK-8检测细胞活性 向96孔板的待检测细胞加入10% CCK-8溶液培养2 h，每组6个复孔，将100 μL培养液转移至新96孔板，全波长酶标仪检测450 nm处吸光值。

1.2.5 透射电子显微镜观察 将细胞用2.5%戊二醛(pH 7.4)4 ℃固定2 h，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)漂洗，再用1%锇酸室温(20 ℃)固定2 h，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)漂洗；用梯度乙醇脱水，树脂浸透，包埋、切片，用2%醋酸铀饱和水溶液和柠檬酸铅依次染色，电镜观察细胞的超微结构。

2 结果

2.1不同缺氧和复灌时间、Fer-1浓度、Erastin作用时间、Erastin浓度时的细胞活力 与其他时间点比较，大鼠OGD模型8 h复灌12 h时细胞活力明显下降。与Control组比较，在最低浓度Fer-1 0.5 μmol/L时细胞活力明显增强。在Erastin 10 μmol/L时，作用24 h细胞活力明显下降。见图1。

2.2细胞存活状况 与Control组比较，Erastin组、OGD/R组、OGD/R+DMSO组均出现明显的细胞死亡。使用Ferroptosis的抑制剂Fer-1(0.5 μmol/L)后，细胞死亡减少。见图2。

注：A为不同缺氧和复灌时间；B图为不同Fer-1浓度；C图为不同Erastin作用时间；D图为不同Erastin浓度时的细胞活力图1 不同缺氧和复灌时间、Fer-1浓度、Erastin作用时间及Erastin浓度时的细胞活力

注：A为正常培养组(Control)；B为铁死亡激动剂组(Erastin)；C为氧糖剥夺/复灌组(OGD/R)； D为溶剂对照组(OGD/R+DMSO)；E为铁死亡抑制剂组(OGD/R+Fer-1)图2 光学显微镜下各组细胞的存活状况(×100)

注：A为正常培养组(Control)；B为铁死亡激动剂组(Erastin)；C为氧糖剥夺/复灌组(OGD/R)； D为溶剂对照组(OGD/R+DMSO)；E为铁死亡抑制剂组(OGD/R+Fer-1)；图a、b、c、d、e分别为A、B、C、D、E选中区域的放大图；箭头指示Ferroptosis的特异性改变图3 各组不同细胞的超微结构

2.3细胞活力 与Control组比较，OGD/R组细胞活力明显下降(P<0.001)；与OGD/R组比较，给予抑制剂Fer-1后能够明显提高细胞活力(P<0.05)；与OGD/R组比较，Erastin组、OGD/R+DMSO组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组的细胞活力比较

2.4细胞的超微结构 Control组显示的是H9c2细胞正常的超微结构，与Control组比较，Erastin组、OGD/R组、OGD/R+DMSO组及OGD/R+Fer-1组都发现大量脂质沉积，可见线粒体体积缩小，双层脂质膜密度增加。使用Ferroptosis抑制剂Fer-1后，脂质密度较OGD/R组减少。见图3。

3 讨论

近年来，我国人群心血管病发病率和病死率有持续上升的趋势，而AMI是心血管系统疾病中的急危重症，发生率逐年增高[5]。根据2019年《急性ST段抬高型心肌梗死诊断和治疗指南》要求，尽快恢复心肌再灌注，在时间窗内首选急诊经皮冠状动脉介入术[6]，但再灌注导致MIRI，可加重心肌损伤、心功能障碍，诱发心肌细胞凋亡、死亡和心律失常，因此，如何减轻MIRI成为研究的热点。近期研究[7]发现，MIRI中细胞死亡除了有凋亡、坏死、自噬性细胞死亡外，还有一种新的死亡方式——铁死亡。铁死亡是一种铁离子依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型程序性细胞死亡形式[8-9]。

过去几年中，科学家发现，一些小分子化合物可以诱导RAS基因突变的肿瘤细胞发生一种新型的死亡[10]。这些小分子物质包括Erastin、SAS等，被称为选择性致死药物(RAS-selective lethal， RSLs)[11-12]。进一步研究[13]表明，Erastin诱导的细胞死亡主要特征是细胞内铁依赖性ROS异常增高、氧化还原稳态失衡，将其命名为Ferroptosis。目前认为，Ferroptosis与凋亡、坏死和自噬在形态学、生物化学和遗传学等方面均有明显差异。Ferroptosis典型特征为线粒体变小，双层膜的密度增加，细胞脂质活性氧增多[14]。Fer-1是一种人为合成的分子量为262的芳烷基胺，常作为食物中防腐剂及化学材料抗氧化剂，Fer-1对Ferroptosis的抑制作用主要是通过抗氧化作用清除脂质ROS实现的[15-16]。

本实验通过OGD模型后再予含有20%血清正常培养心肌细胞12 h模拟MIRI，通过光学显微镜观察细胞结构和CCK-8检测细胞活力，并用透射电子显微镜观察细胞的超微结构来研究MIRI后发生Ferroptosis，并研究Ferroptosis的作用。光学显微镜结果所示，使用Erastin和OGD/R等方式处理细胞后均可使H9c2细胞明显死亡，并用CCK-8检测细胞的存活率，提示实验模型成功(P<0.05)。使用Fer-1后，细胞的存活率明显增加，表明Fer-1可以减少OGD/R后心肌细胞的死亡。为了验证Fer-1对H9c2细胞OGD/R后有保护作用，采用CCK-8试剂盒检测不同组的细胞活力(见表1)，也得到相应的趋势。本研究表明，Fer-1可降低OGD/R后心肌细胞的死亡率，对OGD/R心肌细胞有保护作用，说明OGD/R后心肌细胞可能存在Ferroptosis。为了进一步验证OGD/R存在Ferroptosis，本实验使用透射电子显微镜观察不同实验组细胞的超微结构发现，OGD/R组及Erastin组均发现细胞中出现大量的脂质沉积、双层密度膜增加。在OGD/R中发现了和Erastin类似的结构改变，表示OGD/R后心肌细胞发生了和Erastin相同的细胞死亡，考虑在OGD/R中可能存在Ferroptosis。本研究采用了Fer-1进一步验证，发现使用Fer-1后心肌细胞内脂质沉积较少，双层膜密度较少，说明应用Fer-1后可减少OGD/R后心肌细胞脂质沉积。这与光学显微镜及细胞活力检测的结果一致，说明OGD/R中可能存在Ferroptosis。

通过实验结果发现，Erastin组和OGD/R组细胞的超微结构类似，两组CCK-8值比较差异无统计学意义(P>0.05)。考虑Erastin是通过减少胱氨酸的摄入，从而降低谷胱甘肽的含量，导致其过氧化物酶活性降低，引起脂质过氧化[17-18]。AMI时存在氨基酸及营养物质等缺乏，急诊介入后有血液的再灌注，因此猜测，OGD/R模型中产生的Ferroptosis和Erastin一样通过谷胱甘肽调节细胞内的氧化平衡。

本实验初步验证，MIRI后存在铁死亡，以及铁死亡通过降低细胞活性导致细胞死亡，为后续研究铁死亡的机制提供了基础，对于治疗MIRI具有重要的理论价值和临床意义。