张欣桐， 蒲 晨， 杜转环， 李 盼， 刘景卓， 甄玲玲， 马 莉

脓毒症是宿主对感染产生的全身性炎症反应失调，常常引起多器官功能障碍甚至危及生命[1]。肝脏是最早累及的器官之一，重症感染、炎症反应的过度激活、微循环衰竭及治疗副作用均可引起急性肝损伤[2]，脓毒症中急性肝损伤患者占总患病人数的34%～46%[3]，减轻肝损伤可显著降低脓毒症患者的死亡率[4-5]。目前尚无针对脓毒症急性肝损伤有效的治疗方法，积极探讨其相关分子机制，可能为脓毒症急性肝损伤的治疗提供新的思路和方法。

信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3， STAT3)信号通路与酪氨酸磷酸化信号通路偶联，调控细胞内基因转录过程，参与各类细胞凋亡和炎症反应。Wang等[6]研究人员采用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导大鼠脓毒症急性肺损伤，发现大鼠血清中白细胞介素-6(interleukin 6， IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin 1β， IL-1β)等炎性细胞因子水平均上调(P<0.05)，肺组织磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3， p-STAT3)蛋白表达上调(P<0.05)，研究证实，STAT3信号通路与脓毒症密切相关。而细胞因子信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3， SOCS3)属于SOCS家族，SOCS蛋白通过与磷酸化STAT相互作用来阻断信号转导过程，是STAT信号通路重要的负调控因子[7-9]。

近年研究[10]表明，β1-受体阻滞剂可抑制炎症反应，改善脓毒症预后。艾司洛尔为超短效选择性β1-受体阻滞剂，通过与儿茶酚胺竞争性结合β-受体，从而抑制交感神经活动的过度兴奋。一项Meta分析[11]表明，艾司洛尔提高脓毒性休克和脓毒症患者的生存率。既往研究多局限于艾司洛尔对脓毒症心肌功能障碍的影响[12]，然而艾司洛尔对脓毒症急性肝损伤的作用机制尚不明确。盲肠结扎穿孔(cecal ligation puncture, CLP)法操作简单，具有与人类脓毒症病程进展高度相似的特点，是脓毒症造模的经典方法。本研究拟采用CLP法建立脓毒症大鼠模型，探究艾司洛尔对脓毒症急性肝损伤的保护作用及其可能的信号通路，从而为脓毒症急性肝损伤的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 从兰州大学实验动物中心(中国甘肃)购入健康雄性SPF级Sprague-Dawley大鼠48只(体质量250～300 g)，适应性喂养1周。按照随机数字表法将大鼠随机分为三组，包括假手术组(Sham组，n=16)，盲肠结扎穿孔组(CLP+NS组，n=16)和艾司洛尔干预组(CLP+ES组，n=16)。所有方案均根据《美国国立卫生研究院准则》进行，本研究已得到兰州大学第二医院动物伦理委员会的批准(伦理审批号：D2021-253)。

1.2主要试剂 戊巴比妥钠(上海中秦化学试剂有限公司)、艾司洛尔(齐鲁制药有限公司)、 酶联免疫试剂盒(上海将来实业股份有限公司)、BCA 蛋白测定试剂盒(Biosharp)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性检测试剂盒、SOCS3一抗、辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG二抗均购自Proteintech公司，STAT3、p-STAT3一抗购自Cell Signaling Technology公司。

1.2实验方法

1.2.1 脓毒症动物模型的建立 如前所述[13]，CLP法建立脓毒症大鼠模型：向大鼠腹膜内注射1%戊巴比妥溶液(40 mg/kg)进行麻醉，腹部备皮、消毒、铺无菌洞巾。然后沿腹中线切开1～2 cm纵行切口并暴露盲肠，用4.0丝线在距盲肠末端1 cm处钝性分离并结扎盲肠，用18G注射器针头穿透盲肠2次并挤出少许肠内容物至大鼠腹腔内，回纳盲肠并逐层关腹。为确保一致性，所有CLP操作均由同一操作员执行，术后给予大鼠皮下注射无菌生理盐水(20 mL/kg)进行液体复苏。其中，CLP+NS组和CLP+ES组中大鼠行盲肠结扎穿刺术。Sham组大鼠行盲肠探查术，即翻动盲肠后关腹。

1.2.2 颈内静脉置管 沿大鼠左颈部皮肤从左上至右下切开一1.5 cm斜行切口，暴露并钝性分离左侧颈内静脉，缝线结扎血管远心端，用眼科剪剪一“V”形切口并将预冲肝素钠盐水的一次性硬脊膜外麻醉导管成功置入，固定导管并用湿润纱布覆盖手术切口。

1.3.3 给药 CLP+ES组大鼠经颈内静脉给予15 mg/(kg·h) 艾司洛尔稀释液持续微量泵入6 h。Sham组和CLP+NS组大鼠经颈内静脉持续微量泵入等质量生理盐水6 h。液体输注完成后，拔出硬脊膜外麻醉导管并结扎血管、缝合手术切口后大鼠自由进食进水。

1.3标本采集和相关因子检测

1.3.1 标本采集 术后6 h、24 h，分别取8只大鼠进行心脏取血，室温下静置采血管1 h后在4 ℃、3000 r/min、5 min的条件下进行离心，收集血清并保存在-80 ℃冰箱，用于检测肝功能指标。大鼠麻醉后行安乐死，生理盐水灌洗肝脏，收集肝组织标本。其中1/3用于病理学观察，1/3用于检测肝组织炎性细胞因子水平，1/3用于检测STAT3信号通路的关键蛋白表达情况。

1.3.2 HE染色进行病理学观察 采用4%多聚甲醛缓冲液固定肝组织，脱水、包埋、制作石蜡切片及HE染色，并在光镜下观察肝细胞形态学变化。

1.3.3 生化分析仪检测肝功能指标 术后6 h、24 h，生化分析仪检测血清天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase， AST)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase， ALT)水平。

1.3.3 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)检测肝组织炎性细胞因子水平 电子天平对各组肝组织称质量并置于EP管中，按比例依次向EP管中加入PBS缓冲液,用电动匀浆器在冰上充分研磨大鼠肝组织,直至形成肝组织混悬液。然后在4 ℃、5000 r/min、10 min的条件下离心肝组织混悬液,收集淡黄色上清液即肝组织匀浆。根据ELISA试剂盒说明书检测术后6 h、24 h肝组织匀浆中高迁移率族蛋白B-1(hig h mobility group box-1 protein， HMGB-1)和IL-6水平。

1.3.4 Western blot检测STAT3信号通路标志蛋白表达水平 电子天平对各组肝组织称质量并置于EP管中，按比例依次向EP管中加入RIPA裂解液,用电动匀浆器在冰上充分研磨大鼠肝组织,直至形成肝组织混悬液。然后在4 ℃、5000 r/min、10 min的条件下离心肝组织混悬液,收集淡黄色上清液即肝组织匀浆。BCA检测各组肝组织匀浆的蛋白浓度，肝组织匀浆蛋白充分变性后，通过在SDS-PAGE凝胶上电泳对目的蛋白进行分离，采用湿转法将目的蛋白转移到经甲醇活化的PVDF膜上，接着在摇床上常温封闭抗体1.5 h，4 ℃孵育一抗STAT3、p-STAT3、SOCS3过夜，1×TBST稀释液洗涤3次后常温孵育二抗2 h，再用1×TBST稀释液洗涤3次，最后采用ECL发光液在化学发光成像系统中对PVDF膜进行曝光成像，并应用Image J软件测定条带灰度值，进行蛋白定量分析。

2 结果

2.1艾司洛尔减轻肝组织病理损伤程度，发挥保护肝组织作用 镜下可见，术后6 h、24 h Sham组肝组织中无炎性细胞浸润，肝细胞排列整齐，肝界板完整，肝窦清晰可见；而CLP+NS组肝组织炎性细胞浸润明显，肝细胞形态紊乱，中央静脉与汇管区之间形成桥接坏死，胞浆透明，液泡变性，且24 h较6 h病理损伤程度更重；术后6 h、24 h CLP+ES组较CLP+NS组肝细胞坏死及炎性浸润程度均明显好转，肝细胞排列基本趋于整齐，细胞形态基本正常，液泡变性明显改善。见图1。

2.2艾司洛尔降低血清ALT、AST水平 与Sham组比较，CLP+NS组大鼠血清ALT、AST水平在术后6 h、24 h明显升高，于术后24 h达高峰(P<0.05)。CLP+ES组ALT、AST水平在术后6 h、24 h同样出现升高，各时间点ALT、AST水平均低于CLP+NS组(P<0.05)。见表1。

注：黑色箭头表示炎性细胞浸润，红色箭头表示肝细胞坏死，黄色箭头表示液泡变性；Sham组为假手术组，CLP+NS组为盲肠结扎穿孔组，CLP+ES组为艾司洛尔干预组图1 各组大鼠肝组织形态学变化(HE，×200)

表1 各组大鼠血清ALT、AST水平

2.3艾司洛尔抑制肝组织中炎症因子HMGB-1、IL-6的释放 与Sham组比较，CLP+NS组大鼠肝组织匀浆中HMGB-1、IL-6水平在术后6 h、24 h明显升高(P<0.05)，于24 h达高峰。CLP+ES组HMGB-1、IL-6在术后6 h、24 h同样出现升高,各时间点HMGB-1、IL-6水平均低于CLP+NS组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肝组织匀浆IL-6及HMGB-1水平

2.4艾司洛尔抑制p-STAT3蛋白表达，增加SOCS3蛋白表达 术后6 h、24 h，与Sham组比较, CLP+NS组p-STAT3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。SOCS3蛋白表达趋势与p-STAT3蛋白恰恰相反(P<0.05)。术后6 h，CLP+ES组p-STAT3蛋白表达水平较CLP+NS组明显降低(P<0.05)，SOCS3蛋白表达水平较CLP+NS组明显升高(P<0.05)。术后24 h，与CLP+NS组比较，CLP+ES组p-STAT3蛋白表达水平有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。SOCS3蛋白表达水平有所升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表3。

图2 各组大鼠肝组织STAT3信号通路蛋白表达

表3 各组大鼠术后6 h、24 h肝组织p-STAT3及SOCS3蛋白相对表达水平

3 讨论

从本质上讲，脓毒症是一种由机体免疫反应过度激活引起的炎症性疾病[14]，机体交感神经兴奋，β-受体被活化，释放大量炎性细胞因子，引起强烈炎症反应，造成重要器官损伤。既往研究[15-16]证实，艾司洛尔在脓毒症中应用广泛，不仅减慢脓毒症患者心率、减轻心肌损伤和改善左心室的舒张功能，而且可以抑制炎症反应和细胞凋亡过程[17]。目前，艾司洛尔是否对脓毒症急性肝损伤有保护作用的相关研究较少。基于此，本研究初步探讨艾司洛尔通过STAT3信号通路，减少炎性细胞因子的释放，改善脓毒症急性肝损伤程度，旨在完善艾司洛尔在脓毒症中的脏器保护作用，以期为临床治疗脓毒症提供新的思路和方法。

机体释放过量炎性细胞因子在急性肝损伤的发病机制中发挥关键作用，加重肝组织的损伤程度。脓毒症致急性肝损伤时，肝细胞被过量炎性细胞因子破坏，引起ALT、AST释放入血。肝脏中巨噬细胞-Kupffer细胞被激活，可释放IL-6等炎性细胞因子，而IL-6是脓毒症早期释放的主要炎性细胞因子之一,可激活STAT3信号通路[18-19]，促进HMGB-1等因子释放，从而调节脓毒症等病理条件下多种细胞因子水平[20]。艾司洛尔在脓毒症模型中具有较好的抗炎潜力[21-22]。本研究结果显示，艾司洛尔能明显下调血清ALT、AST水平，减少肝组织炎性细胞因子HMGB-1、IL-6释放，提示艾司洛尔可减轻CLP诱导的大鼠急性肝损伤。研究[17]证实，与脓毒症大鼠肝组织相比，艾司洛尔干预后肝脏病理切片表现为正常肝小叶，肝窦中性粒细胞浸润不明显，肝脏仅表现为中央静脉缺血，证实艾司洛尔能减轻脓毒症大鼠炎症，保护肝功能，这一结果在本研究中得到验证。

STAT3蛋白是炎症反应的主要介质之一，STAT3信号通路的活化与多种炎症疾病的发生密切相关，如溃疡性结肠炎[23]、类风湿关节炎[24]及脓毒症[6]等，尤其在脓毒症介导的炎症反应中作用显著，该信号通路对γ-干扰素、肿瘤坏死因子-α等促炎因子的产生具有重要影响。为了明确艾司洛尔与脓毒症急性肝损伤的具体作用机制，本研究检测脓毒症大鼠肝组织中STAT3信号通路的关键蛋白STAT3、p-STAT3和SOCS3的表达水平，结果显示，艾司洛尔可下调肝组织p-STAT3蛋白表达水平，同时SOCS3蛋白表达明显上调，但STAT3蛋白表达水平并无明显差异。提示艾司洛尔可通过抑制STAT3磷酸化，影响STAT3信号通路，改善脓毒症急性肝损伤。Samar Imbaby等[25]研究发现，抑制STAT3通路可减少炎性细胞因子的释放，减轻组织损伤，最大程度地避免脓毒症大鼠器官衰竭的发生。研究[26]发现，肝组织中p-STAT3蛋白表达增多可加重大鼠肝损伤，SOCS3蛋白表达上调有利于急性肝损伤的恢复。STAT3蛋白磷酸化的失活可减少p-STAT3蛋白的表达，明显抑制炎症反应和氧化应激过程，增加脓毒症大鼠的存活率、减少肺损伤。上述研究与本研究中艾司洛尔抑制p-STAT3蛋白表达水平，保护脓毒症大鼠肝功能的结论是一致的。值得注意的是，在本研究结果中，CLP+ES组p-STAT3、SOCS3蛋白表达水平在术后24 h较CLP+NS组均无统计学意义(P>0.05)。究其原因，考虑与艾司洛尔的药物半衰期较短，干预时间仅为6 h有关。

已知雷帕霉素是STAT3蛋白的特异性抑制剂，该药物可直接抑制脓毒症大鼠肝、肺组织STAT3的活性和STAT3 mRNA表达水平[27]。有研究[28]发现，CLP+雷帕霉素组血清中 ALT、AST 和肝组织中HMGB-1 水平较CLP组明显下降，而且CLP+雷帕霉素组大鼠存活率较CLP组明显升高(CLP+雷帕霉素组vs. CLP组为37.5% vs. 70.8%)，表明抑制STAT3能够保护脓毒症大鼠的肝功能，有效提高存活率。王松柏等[29]在CLP造模前向大鼠皮下注射酪氨酸激酶(JAK)抑制剂-AG490或雷帕霉素后，AG490组和雷帕霉素组大鼠血清中肝功能指标ALT、AST均明显下降，两组大鼠肝组织HMGB-1转录水平较CLP组均下降。由此猜测，STAT3信号通路的上游可能由JAK激活，炎性细胞因子通过活化JAK，进而调节下游p-STAT3和负反馈调节蛋白-SOCS3蛋白表达水平，影响急性肝损伤病程。本研究的不足之处在于：该研究尚未应用STAT3信号通路的特异性抑制剂进行干预明确艾司洛尔与该信号通路的直接关系，仅能证实脓毒症急性肝损伤时艾司洛尔可通过STAT3信号通路保护肝功能。毋庸置疑，仍需要进一步实验来阐明。

综上所述，艾司洛尔可通过抑制STAT3信号通路，减少炎性细胞因子的释放，保护脓毒症大鼠肝功能。本研究提示，该药物可能是治疗脓毒症急性肝损伤的新药物，有利于艾司洛尔更好地应用于脓毒症的临床治疗。