张春，丁甜甜，李慧，刘远婷，郑茜

(1.新疆医科大学动物实验中心；2.新疆医科大学第七附属医院中医科，新疆 乌鲁木齐 830000)

肺癌发病率居全球恶性肿瘤前列，发病率高达45.39%[1]，由于肺癌诊断时多处于中晚期，治疗效果不甚理想，5年生存率<20%[2]。手术、放化疗及靶向药物治疗是主要治疗方式，但手术治疗对适应证的要求较高，仅限于Ⅰ～Ⅲa期肺癌[3]；放化疗及靶向药物治疗伴随的不良反应明显，部分患者不耐受[4]。中医药防治肿瘤已有数千年历史，积累了宝贵经验，根据中医辨证施治可恢复和增强机体自然免疫力，扶正固本，起到辅助抗肿瘤作用。肿瘤的生长与扩散具有血管依赖性[5]，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在肿瘤发生发展中起到关键作用[6-7]，抗肿瘤血管生成药物成为肺癌不可或缺的治疗手段之一，其可使现有肿瘤血管退化，并抑制肿瘤新生血管生成，从而阻断肿瘤生长必须的营养供给[8]。本研究拟采用Lewis肺癌荷瘤小鼠模型观察消积抑癌外敷方对肿瘤血管生成及VEGF表达的影响，探讨消积抑癌外敷方的抗肿瘤效果和作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雌性C57BL/6小鼠20只，体质量(20±2)g，4～6周龄，购自新疆医科大学动物实验中心[许可证号：SCXK(新) 2018-0002)]。Lewis肺癌细胞株选自新疆医科大学动物实验中心。

1.2 主要实验仪器和试剂

SSB-2超净台(上海净化设备厂)、5%CO2恒温培养箱(美国力高公司)、倒置相差显微镜(日本Olympus公司)、低温高速离心机(上海医用分析仪器厂)、HR-200型电子天平(日本LIMITED公司)、细胞培养瓶(德国Greiner公司)、Prism7000型荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(美国ABI公司)、组织包埋机和石蜡切片机(德国Leica公司)。VEGF单克隆抗体试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)；荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)配套试剂盒和总核糖核酸(RNA)抽提试剂购自美国Thermo Scientific公司；VEGF信使核糖核酸(mRNA)引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

消积抑癌外敷方：当归30 g、川芎30 g、乳香30 g、没药30 g、红花30 g、赤芍30 g、五灵脂60 g、莪术120 g、苦参120 g、山慈菇120 g、透骨草60 g、全蝎40 g、蜈蚣40条、猪蹄甲30 g、土鳖虫40 g、商陆120 g、元胡120 g、青黛60 g、拳参40 g、仙鹤草60 g、丹皮60 g、白鲜皮60 g、丹参30 g、浙贝母120 g、乌梅120 g、蜂房120 g、蛇莓60 g、冰片9 g，将冰片溶解于46°白酒500 mL中制备成冰片酒。上述中药材研成粉末，用46°冰片酒调和成膏状，消毒灭菌装瓶，制成外敷膏剂。外敷膏剂由新疆医科大学第七附属医院中药房制备，鉴定及方剂质量控制由新疆医科大学药学院负责，采用薄层色谱法鉴别外敷膏剂的活性成分，其中当归、川芎、乳香、没药、红花等中药成分的分离度较好、专属性较强，阴性对照无明显干扰。外敷膏剂成型性好，具有适宜的机械强度和黏附性，制备工艺稳定合理，质量控制方法准确、可靠、专属性强，质量评价较优。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备及分组 实验前C57BL/6小鼠适应性喂养7 d。采用动物移植肿瘤实验法制备Lewis肺癌荷瘤小鼠模型[9]。将Lewis肺癌细胞株的冻存管从液氮中取出，迅速放入37 ℃的水浴锅中至内容物完全融化，约3 min快速复苏，置于完全培养基中，移入37 ℃恒温、5%CO2细胞培养箱中培养并传代。当细胞处于指数生长期时，取生长良好的细胞经胰酶消化后，用计数板计数，将浓度调整至1×107个/mL以供注射。将2×106个Lewis肺癌细胞接种于每只小鼠皮下，制备Lewis肺癌小鼠模型，每天检查肿瘤生长情况，接种8 d后开始实验。20只C57BL/6小鼠随机分为荷瘤对照组和治疗组，每组各10只。

1.3.2 治疗方法 对照组小鼠瘤体表面外敷面糊(面粉+生理盐水调成糊状物)，面糊加热至30 ℃使用，30 min/次，3次/d，连续30 d。治疗组小鼠瘤体表面外敷消积抑癌膏，按照0.79 mL/20 g体重标准给药，膏药加热至30 ℃使用，30 min/次，3次/d，连续30 d。

1.4 检测指标

(1)疗程结束后处死小鼠，剥离肿瘤组织称重瘤质量；将肿瘤组织分为两部分，一部分用多聚甲醛固定，另一部分冷冻于液氮中备用；(2)免疫组化法检测CD34和VEGF蛋白表达量，多聚甲醛固定组织，经过脱水、固定、包埋等步骤制作石蜡切片，石蜡切片浸泡于500 mL的抗原修复工作液，加热煮沸20 min后冷却至室温，取出组织切片用磷酸盐缓冲液冲洗3 min、自来水冲洗3 min。组织切片晾干后滴加10%非免疫羊血清，孵育30 min。链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP)进行免疫组化染色：加入CD34和VEGF单克隆抗体试剂盒中的一抗工作液40 μL，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的CD34和VEGF二抗工作液，37 ℃孵育30 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5 min。滴加二氨基联苯胺显色液50 μL，染色时间大约5～10 min，显微镜下观察。CD34染色标记微血管进行微血管密度计数，计算肿瘤组织中CD34染色的微小血管。(3)Western blot检测VEGF蛋白表达，100 mg液氮冷冻的肿瘤组织，加入蛋白裂解液1 mL，1 000～3 000 rpm高速匀浆3次，离心取上清液，调整所有蛋白样本至等浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到硝酸纤维束薄膜上，封闭，加入VEGF一抗，4 ℃孵育过夜。取膜，磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5 min。再加入辣根过氧化物酶标记的VEGF二抗，封口，37 ℃孵育1 h。磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次10 min。采用辣根过氧化物酶化学发光法(HRP-ECL)曝光，将膜置于曝光板上，取出胶片浸入显影液至完全曝光，清水冲净晾干。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照计算VEGF蛋白的相对表达量。(4)RT-qPCR法检测VEGF mRNA相对表达量， 100 mg液氮冷冻的肿瘤组织用0.25%胰蛋白酶消化细胞，10 000 rpm离心弃上清，加入Trizol试剂抽提细胞总RNA，干燥RNA沉淀物，保存于-20 ℃待检。VEGF上游引物：5′-TCA GGT CTG CTC AT TCT TA-3′，下游引物：5′-CAG CCA TTC AGT CTA CGT-3′，扩增片段474 bp，β-actin为内参基因，上游引物：5′-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3′，下游引物：5′- GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′，扩增片段268 bp。将相关试剂(逆转录酶10 U、核糖核酸抑制酶2 μmol/L、dNTP 2.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶5 μmol/L，引物5 μmol/L等，反应体积100 μL)置于冰盒上，混匀。将离心管置于预热的Prism7000型荧光定量PCR仪， RT-qPCR反应条件：96 ℃ 4 min， 94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。按照RT-qPCR说明书，采用2-ΔΔCt法计算VEGF mRNA相对表达量。

1.5 VEGF蛋白评分标准

由病理中心两名医师独立阅片，采用Bresalier半定量法分两部分评分[10]：(1)染色深浅度评分：0分为不显色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；(2)阳性细胞数评分：0分为阳性细胞数<5%，1分为阳性细胞数5～25%，2分为阳性细胞数26%～50%，3分为阳性细胞数51%～75%，4分为阳性细胞数≥76%。累计得分0～1分为(﹣)，2～3分为(+)，4～5分为(++)，6～7分为(+++)。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 两组小鼠瘤质量比较

治疗组的瘤质量(1.37±0.28)g低于荷瘤对照组(0.61±0.15)g，差异有统计学意义(t=7.566，P<0.001)。见图1。

2.2 两组微血管密度计数比较

治疗组的微血管密度计数(43.59±8.33)小于荷瘤对照组(30.34±6.45)，差异有统计学意义(t=3.977，P=0.001)。见图2。

2.3 两组VEGF蛋白表达水平比较

对照组和治疗组的VEGF表达均为阳性，且治疗组VEGF表达的阳性等级低于对照组。治疗组的VEGF蛋白表达量(1.07±0.26)低于荷瘤对照组(0.76±0.19)，差异有统计学意义(t=3.044，P=0.007)。见表1、图3及图4。

表1 免疫组化VEGF蛋白表达水平比较 [n(%)]

2.4 两组VEGF mRNA表达量比较

治疗组的VEGF mRNA相对表达量(1.93±0.47)低于对照组(1.35±0.34)，差异有统计学意义(t=3.162，P<0.005)。见图5。

3 讨论

本研究探讨消积抑癌外敷方对Lewis肺癌荷瘤小鼠的肿瘤血管生成以及VEGF表达的影响，结果显示，治疗组的微血管密度计数小于荷瘤对照组，说明消积抑癌外敷方可以抑制肿瘤血管生成。荷瘤对照组、治疗组的VEGF表达均为阳性，但治疗组VEGF表达的阳性等级低于荷瘤对照组，并且治疗组的VEGF蛋白表达量以及VEGF mRNA低于荷瘤对照组，上述可以证明消积抑癌外敷方可下调Lewis肺癌荷瘤小鼠VEGF表达，具有抗肿瘤潜力。

中医药理认为肺癌的发病以脏腑亏虚、气血失调、正气不足为内因，内邪伏留易致外邪侵袭，在各种致癌因素的作用下，外感病日久不愈，邪气伏着不解，成为内伏之邪，内外合邪发病，引起人体气滞血瘀，痰凝毒结，形成肿瘤[11]。瘀血、痰浊是肺癌的主要病机，因此肺癌的治疗应从整体观念出发，采用活血化瘀的治疗方法[12]。本研究所采用的消积抑癌方多选用虫类药甚至有毒的药物以通络消积、以毒攻毒，如全蝎、蜈蚣、猪蹄甲、土鳖虫；选用活血破瘀消积类药物以清瘀毒，如当归、川芎、乳香、没药、红花、赤芍、五灵脂、莪术、丹参、透骨草；选用清热解毒散结类药物如苦参、山慈菇、商陆、元胡、青黛、拳参、仙鹤草、丹皮、白鲜皮；浙贝母、乌梅，蜂房、蛇莓；辅以冰片、白酒的辛散透皮，引药到达病所。上述药物组方严谨，君臣佐使，诸药配伍共奏清热解毒、活血消积、以毒攻毒之功效。从西医病理机制的角度分析，肿瘤血管生成为肿瘤迅速生长、侵袭和转移提供营养和能量。VEGF是肿瘤血管生成刺激因子，可促进血管内皮细胞增殖，诱导肿瘤新生血管形成，提高血管通透性，加速肿瘤细胞的转移扩散[13-14]。本研究发现，治疗组的微血管密度计数、瘤质量、VEGF蛋白和VEGF mRNA表达量均少于对照组，说明消积抑癌外敷方可抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长，具有抗肿瘤潜力。孙国钧等[15]指出由黄芪、白术、石见穿、蜂房等中药组成的益气消征方，可行气活血、散瘀止痛、攻毒效果，降低Lewis荷瘤小鼠VEGF蛋白和VEGF mRNA的表达，减慢肿瘤的生长速度，降低肿瘤血管形成率；Zhang等[16]也表示大黄酚活性成分通过调节ROS/HIF-1a/VEGF信号通路，抑制CD31、CD34和血管生成素的表达，进而阻碍肺癌肿瘤血管生成，上述两项报道均与本研究结论一致。这可能是因为：消积抑癌外敷方的中药成分如当归、苦参、川穹等能够有效抑制VEGF，从而阻断肿瘤血管生成，抑制肿瘤生长，作用机制可能与阻断JAK2/STAT3信号通路、减轻机体免疫抑制、下调瘤组织基质金属蛋白酶13和成纤维细胞生长因子2的表达有关[17]。

综上所述，消积抑癌外敷方可下调Lewis肺癌荷瘤小鼠VEGF表达，抑制肿瘤血管生成，减轻瘤质量，为临床治疗提供新的思路法。