钟芳芳，杨友，郭铃，刘静，曾艳，马文哲，刘文君

(1.澳门科技大学中医药学院，澳门 999078;2.西南医科大学附属医院儿科·四川省出生缺陷临床医学研究中心·出生缺陷及儿童血液肿瘤实验室，四川 泸州 646000；3.澳门科技大学中药质量研究重点实验室，澳门 999078)

过敏性紫癜(henoch-sehtlnlein purpura，HSP)以特征性皮损，常累及关节、胃肠道、肾脏等脏器为主要表现，是儿童时期最常见的小血管炎疾病[1-3]。紫癜性肾炎(henoch-schonlein purpura nephritis，HSPN)指HSP患儿出现肾脏损害，是影响过敏性紫癜远期预后并导致患儿死亡的主要原因[4-6]。目前，HSP的发病率呈逐年上升趋势，但机制仍不清楚。现有证据[7-9]表明，感染和遗传因素是HSP发病的两个重要因素。IL-17是深度参与了机体炎症和免疫反应的细胞因子，近年各类免疫性和感染性疾病的易感性与IL-17基因多态性的关系是研究的热点。目前，已有川崎病、支气管哮喘、炎症性肠病等免疫性疾病的易感性与IL-17A基因多态性相关的报告[10-12]。本课题组既往研究也发现，IL-17A的-692C/T、-197G/A两个位点的基因多态性与儿童川崎病、儿童哮喘等风湿免疫性疾病易感性相关。还有研究[13]表明，相同的基因多态性可以通过共通的致病通路导致不同的免疫相关性疾病的发生。本研究旨在通过分析IL-17基因(-197G/A、-692C/T)基因型分布频率，揭示IL-17A这两个位点的基因多态性与儿童过敏性紫癜易感性及肾脏损害的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年12月至2019年11月西南医科大学附属医院门诊随访及住院的380例HSP患儿(HSP组)及同地区同时间段405名健康儿童(对照组)为研究对象。HSP组中，男性202例，女性178例，平均年龄(7.2±2.1)岁。对照组中，男性216名，女性189名，平均年龄(6.9±2.3)岁。HSP组依据有无肾脏损伤分为紫癜性肾炎组(HSPN组，n=115)和非紫癜性肾炎组(非HSPN组，n=265)。本研究经医院伦理委员会批准。纳入标准：(1)HSP符合《诸福棠实用儿科学》关于儿童过敏性紫癜的诊断标准[14]；(2)年龄<14岁；(3)近期无发热感染病史；(4)患儿家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及引物合成 采用DNA提取试剂盒(天根生物,中国)通过每例入选对象的外周静脉血提取人基因组DNA；由上海生工公司合成根据已知人基因序列、IL-17A两位点的SNPs和相应的引物设计原则自行设计两位点的序列特异性引物。见表1。

1.2.2 SSP-PCR反应 反应体系分别由2 μL模板DNA，0.5 μL特异性引物F1(或F2)，0.5 μL内参正向C，8.5 μL通用反向引物，12.5 μL 2×Power Taq Master Mix组成，最后由8.5 μL ddH2O补足25 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min；然后进入35各循环，94 ℃变性30 s，退火(温度见表1)40 s，72 ℃延伸40 min；最后72 ℃再延伸5 min。

1.2.3 SSP-PCR产物电泳 配制1.5%琼脂糖凝胶，每个样孔中加入5 μLPCR产物，将凝胶放入电泳仪(0.5×TAE缓冲液)中电泳35 min(电压110 V，室温)后，用自动凝胶成像仪(基因公司,英国)里查看凝胶电泳图谱。见图1。

1.2.4 PCR产物测序 为验证实验所用的SSP-PCR法检测的准确性和可靠性，将经上述实验初步确定了IL-17A基因两个位点基因型的样本随机各选取3份，应用内参引物(C，R)进行PCR扩增，得到的产物送至上海生工公司进行DNA测序。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0软件对数据进行分析与处理。应用直接计数法表示两位点基因型和等位基因，两组间差异采用χ2检验；应用优势比(OR)评估相对危险度，并计算95%可信区间(CI)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 遗传平衡检验

Hardy-Weinbergy遗传平衡定律检验显示，HSP组和健康对照组在IL-17A这两个位点的基因型分布频率均达到遗传平衡(P>0.05)，说明实验的入选对象具有群体代表性。见表2。

表2 IL-17A各基因型分布频率的Hardy-Weinbergy遗传平衡检验[n(%)，n=405]

2.2 PCR产物测序分析

将随机选取的样本IL-17A两个位点的测序结果与SSP-PCR检测的同一样本的结果进行比对，两者显示的SNP位点的基因型是一致的，证明本研究应用SSP-PCR检测的结果是准确可信的，方法是可行的。

2.3 HSP组与对照组IL-17A-692C/T、-197G/A位点基因型及等位基因分布频率比较

HSP组和对照组IL17A-692C/T位点基因型和等位基因的分布频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而IL-17A -197G/A位点的基因型及等位基因的分布频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。THSP组T基因型分布频率及等位基因T的分布频率高于对照组(P<0.05)。HSPN组和非HSPN组IL-17A(-197G/A、-692C/T)的基因型和等位基因分布频率差异无统计学意义(P>0.05)。见表3及表4。

表3 HSP组和对照组IL-17A基因型和等位基因的分布频率[n(%)]

表4 HSPN组和非HSPN组IL-17A基因型和等位基因的分布频率[n(%)]

3 讨论

当前，过敏性紫癜在儿童中的发病率越来高，且重症病例也越来越常见[15]。自200多年前被发现以来，在世界各地都有HSP发病报道，据统计，每年儿童发病率约8～20/10万，其中<5岁患儿约占50%[16]。回顾性研究[17-19]发现，HSP患儿中10%～50%有肾脏损害，且约15%有持续肾脏损害，约8%进展至终末期肾病。紫癜性肾炎成为过敏性紫癜患儿死亡的主要原因，所以，是否累积肾脏是评估过敏性紫癜远期预后的最重要指标[20]。因此，对过敏性紫癜的发病机制和紫癜性肾炎的早期预测指标的研究意义重大，对于易感人群的保护和早期干预将创造极大的社会学和经济学价值。

目前比较公认的是HSP的发生与感染和机体的免疫反应有关，认为是一种或多种病原侵犯易感者，激活机体免疫反应，从而引起大量炎症介质和细胞因子释放，导致瀑布式级联反应，最终使全身的血管受损引起临床症状[21]。虽然目前尚未报道某个特定的基因与HSP的发病直接相关，但是，已报道了多个基因的多态性(C1GALT1基因、血管紧张素转换酶基因、血管紧张素原基因等)与HSP的易感性相关[22-23]。

人体中的IL-17主要是由Th17细胞产生，同时在中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、NKT细胞等多种细胞中也有少量表达[24-25]。目前研究[26]发现，人IL-17家族有6个成员，而通常所说的IL-17就是特指IL-17A。人体分泌的IL-17与IL-17的受体结合后通过多条信号途径可以促进诸如粒细胞趋化蛋白2、IL-6、IL-8等多种因子的核内转录[27]。而机体的多种免疫性、感染性疾病的发生就是由这些因子的聚集并激活炎症瀑布反应而产生的[28-29]。由此可见，IL-17在免疫性及感染性疾病的发生中占有重要地位。目前研究[30-31]也发现，外周血中Th17细胞和血清中的IL-17在HSP患儿中是明显升高的。本课题组既往已发现IL-17A-692C/T、-197G/A基因多态性与川崎病、儿童哮喘等风湿免疫性疾病易感性相关。本文首次探索IL-17A基因这两个位点多态性与过敏性紫癜易感性及肾脏损害的关系。

本研究采用SSP-PCR检测了四川川南地区儿童IL-17A基因的两位点的SNP，通过数据统计分析发现，在川南地区汉族儿童中IL17A基因启动子区-692和-197两位点存在单核苷酸多态性；IL-17A基因-692C/T位点三个基因型CC型，CT型，TT型在川南地区汉族健康儿童的分布分别是30.1%，55.1%，14.8%，等位基因C占57.7%；这与Gilberto等[32]报道的在墨西哥人群中该位点的CC型，CT型，TT型分别是5.0%，33.0%，61.0%有明显的差异，可能与研究所选取的样本的种族和地区不同有关。对比HSP组与对照组发现，IL-17A基因-692位点的TT基因型、T等位基因的分布频率存在统计学差异(P<0.05)，提示此位点的T等位基因可能是儿童HSP发病的易感基因，罹患儿童HSP的风险T等位基因携带者比C等位基因携带者增高。原因可能是启动子区是控制基因转录时间和程度的区域，-692这个多态性位点位于IL-17A的启动子区，该位点的等位基因由C突变为T后可能使IL-17A转录水平发生改变，从而导致IL-17A蛋白的表达发生改变，进一步影响过敏性紫癜的发生发展。多态性位点-197G/A的基因型及等位基因的分布频率在HSP组和对照组中无统计学差异(P>0.05)，提示HSP的易感性可能与-197G/A基因多态性无相关性；同时，本研究还发现，IL-17A的两个基因位点的基因型及等位基因分布在HSPN组和非HSPN组没有统计学差异(P>0.05)，提示IL-17A这两个位点SNP与过敏性紫癜肾脏损害无关。本研究针对于儿童HSP易感性的相关研究数据希望能进一步丰富儿童过敏性紫癜易感基因生物信息数据库，为能进一步寻找到HSP的易感候选基因，以便患病的高风险人群采取早期干预奠定基础。

综上所述，川南地区汉族儿童中HSP的易感性与IL-17A -692C/T基因多态性相关，携带-692位点T等位基因的儿童更易罹患HSP，而IL-17A -197G/A位点多态性与该地区儿童HSP的易感性无相关性，IL-17A两个基因的多态性与儿童HSP肾脏损害亦无相关性。而-692位的多态性与IL-17A蛋白的表达是否相关，则需要进一步进行的功能学相关实验的研究。此外，某个基因的多态性在同一族群的不同区域或者不同族群的同一区域的分布是不尽相同，那么与疾病的易感性也可能存在差异。因此，将研究对象扩展至不同区域、不同族群进行多中心大样本的采集研究，IL-17A基因多态性与儿童过敏性紫癜易感性及肾脏损害的关系才能得到进一步的揭示。