龚晓昕，沈苗苗，李徐梓超，向嵩

（天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，天津 300070）

准确而顺利的DNA复制对于细胞生存至关重要。大量的外源性和内源性因素，例如核苷酸耗竭、DNA二级结构、蛋白质-DNA复合物、DNA碱基损伤等都会对DNA复制造成压力，从而导致复制停滞[1-2]。停滞的复制叉是一种非常不稳定的DNA结构，容易导致DNA双链断裂和核溶解，从而导致基因组不稳定，最终造成细胞死亡[3-4]。细胞进化出复杂的机制来应对这些复制压力。其中，高度保守的真核生物DNA损伤耐受通路（DNA damage tolerance，DDT）通过易出错的跨损伤合成（translesionsynthesis，TLS）和无错误的模板转换DNA合成（template switch，TS）两条分支来恢复被中断的DNA复制[5-6]。解旋酶样转录因子（helicase-like transcription factor，HLTF）在人类细胞的DDT通路中起到关键作用。DDT中TLS分支与TS分支都是通过将增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）高度保守的Lys164泛素化修饰而启动的。泛素连接酶Rad18和泛素结合酶Rad6将该残基单泛素化修饰，启动TLS分支[7]。HLTF具有泛素连接酶活性，它可进一步使用Lys63相连接的泛素链标记PCNA，启动无错误的TS分支。这一反应以单泛素化的PCNA为底物，还需要泛素结合酶复合物Ubc13-Mms2的共同参与[8-10]。除此之外，HLTF还能通过催化ATP水解驱动复制叉退行[11]。在停滞的复制叉处，TS分支可通过复制叉退行实现；复制叉退行也能保护停滞的复制叉[2，12-13]。与HLTF在DNA复制压力应对中的关键功能一致，研究发现HLTF与早衰、神经系统疾病及多种癌症密切相关[1，14]。

HLTF的分子量为114 kD，是一个较为复杂的多结构域蛋白。它由HIRAN结构域、Snf2家族的DNA解旋酶结构域（Snf2结构域）和嵌在其中的RING结构域构成。Snf2结构域驱动复制叉退行；RING结构域编码泛素连接酶活性；HIRAN结构域在复制叉退行中发挥关键作用[8，13，15-17]。本课题组近期对HLTF的酵母同源蛋白Rad5的结构和功能研究为理解HLTF的功能机制提供了线索[18]。本研究表明，HLTF与Rad5催化差异巨大的PCNA的泛素化修饰及复制叉退行。因此，迫切需要对HLTF本身的结构和功能研究以理解它在人体细胞的DNA复制压力应对中发挥作用的机制。制备大量、高纯度且正确折叠的HLTF对该研究至关重要。虽然已有研究人员利用酵母表达系统表达并纯化HLTF[8]，但该表达系统操作较为繁琐，蛋白产量也较为有限。与酵母表达系统相比，细菌表达系统通常耗时更短、蛋白产量更高。然而高等真核生物与细菌之间存在密码子偏好性差异，可能会阻碍高等真核生物蛋白在细菌中的表达。这些物种细胞中蛋白折叠环境的差异，也可能导致在细菌中表达的高等真核生物蛋白不能正确折叠[19-21]。本课题组在前期研究中发现，通过优化HLTF基因的密码子偏好性能够在大肠杆菌表达系统中表达HLTF[18]。本研究优化了HLTF的表达和纯化方式，获得了大量高纯度的HLTF。体外实验结果发现，重组HLTF具有完整的生化活性，提示它是正确折叠的。另外，结果发现HLTF在发挥泛素连接酶活性时对底物PCNA与泛素的连接方式不敏感。本研究提供了一种高效制备大量、高纯度且折叠正确HLTF的方法，并为深入理解其泛素连接酶活性提供了线索，为HLTF的进一步研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 蛋白表达和纯化本研究对本课题组之前报道的HLTF的表达和纯化方法进行了优化[18]。HLTF基因的密码子偏好性优化有利于其在大肠杆菌中表达，由化学方法合成（生工生物技术）。HLTF的氨基酸残基46-1013对应的基因片段插入pET28a载体（Novagen），构建HLTF的表达质粒。将质粒转化大肠杆菌BL21 Rosetta（DE3）感受态细胞，在添加34 mg/L卡那霉素和25 mg/L氯霉素的LB培养基中培养，用终浓度为0.25 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Bio Basic）在16℃诱导14 h。收集的细胞重悬在含有20 mmol/L Tris（pH 7.5）、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L苯甲基磺酰氟和2 mmol/Lβ-巯基乙醇的缓冲液中，每克细胞使用50 mL缓冲液重悬，冷却到4℃，以50 mL/min的流速通过AH-2010高压破碎仪（ATS Engineering），破碎压力设为900磅每平方英尺。经过3次破碎循环后，细胞裂解液经过15 000×g离心50 min，上清部分经过镍-次氮基三乙酸纯化琼脂糖树脂（nickel-nitrilotriacetic acid，Ni-NTA，Smart-Lifesciences）、DEAE柱（Hitrap DEAE HP，GE Healthcare）、SP柱（Hitrap SP HP，GE Healthcare）和分子筛柱（Superose 6 10/300，GE Health care）依次纯化，得到纯度大于95%的HLTF蛋白。

从人乳腺癌MDA-MB-231细胞的cDNA文库（天津医科大学于林教授赠送）中扩增出泛素、PCNA的基因；从人乳腺癌T-47D细胞的cDNA文库（天津医科大学于林教授赠送）中扩增出Mms2基因。Ubc13基因密码子优化为利于在大肠杆菌中表达（生工生物技术）。将泛素基因插入pET28a载体；将Mms2基因插入pTYb2载体（New England Biolabs）；将Ubc13基因插入pTXb1载体（New England Biolabs），构建表达质粒。将FLAG肽段寡核苷酸序列、泛素基因、连接肽段（VQIPGK）核苷酸序列和PCNA基因插入pET28a载体，构建His-FLAG-泛素-PCNA融合蛋白表达质粒。上述重组蛋白均在大肠杆菌BL21 Rosetta（DE3）细胞中表达。泛素和His-FLAG-泛素-PCNA融合蛋白均用Ni-NTA和分子筛柱纯化（泛素蛋白用Superdex 75 Increase 10/300，His-FLAG-泛素-PCNA融合蛋白用Superdex 200 Increase 10/300，均来自GE Healthcare）。Mms2和Ubc13用几丁质树脂（New England Biolabs）和分子筛柱（Superdex 75 Increase 10/300）进行纯化。

所有蛋白质在含有20 mmol/L Tris（pH 7.5）、200 mmol/L NaCl和2 mmol/L二硫苏糖醇的缓冲液中，用液氮速冻后保存在-80℃。

1.2 ATP酶活性实验ATP酶活性实验中使用的双链DNA是通过将互补寡核苷酸（ACCAGTGCCAGTGAT和ATCACTGGCACTGGT，生工生物技术合成）加热至95℃，随后缓慢冷却至4℃生成。实验采用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶耦联反应，通过监测NADH减少来测定ATP酶活性[22]。利用ultraspec 2100 pro分光光度计（GE Healthcare）来监测NADH在340 nm处吸收值的变化。反应体系包括2.5μmol/L HLTF、40 mmol/L Tris（pH 7.5）、50 mmol/L NaCl、0.5 mmol/L ATP（Sigma）、1 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸（Sigma）、0.2 g/L NADH（Sigma）、80单位/mL丙酮酸激酶（源叶生物）、100单位/mL乳酸脱氢酶（源叶生物）、10 mmol/L MgCl2和不同浓度的双链DNA。每次实验重复3次，数据用QTIPLOT分析（www.qtiplot.com）。

1.3 HLTF促进自由泛素链的形成实验反应体系包括20 mmol/L Tris（pH7.5）、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L ATP（Sigma）、0.02 mg/mL BSA、1 mmol/L DTT、33 nmol/L人源泛素激活酶（UBE1，R&D Systems）、667 nmol/L Ubc13、667 nmol/L Mms2、33μmol/L泛素和233 nmol/L HLTF。需要时，将单链DNA（序列为TTTTTTTCGTCTTCGGCAATTTTTTT，生工生物技术合成）或双链DNA（与ATP酶活性实验相同）加入反应体系中，终浓度为6.7μmol/L。

30℃孵育12 min后，加入SDS-PAGE上样缓冲液[20 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8），40 mmol/L DTT，0.8%SDS，0.02%溴酚蓝，4%甘油]煮沸终止反应。通过SDS-PAGE分析反应结果。

1.4 HLTF催化PCNA的泛素链标记实验反应体系包括40 mmol/L Tris（pH7.5）、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L ATP（Sigma）、0.15μmol/L人源泛素激活酶（UBE1，R&D Systems）、2μmol/L Ubc13、2μmol/L Mms2、10μmol/L泛素、0.5μmol/L HLTF和0.05μmol/L His-FLAG-泛素-PCNA融合蛋白。30℃孵育30 min后，加入SDS-PAGE上样缓冲液煮沸终止反应。用抗FLAG抗体（a8592，Sigma-Aldrich）进行Western印迹分析反应结果。

2 结果

2.1 重组HLTF蛋白在细菌中的表达和纯化DEAE柱可去除Ni-NTA纯化HLTFec蛋白时残留的大量杂蛋白和错误折叠的蛋白。通过在纯化流程的Ni-NTA柱步骤后添加DEAE柱步骤可以有效地提高蛋白质的产量和纯化产物的纯度。优化的纯化流程可从7 L的大肠杆菌培养液中制备6 mg纯度大于95%的HLTFec蛋白（图1A）。蛋白从Supersose 6 10/300分子筛柱的16 mL处洗脱出来（图1B），与溶液中HLTF蛋白的单体形式一致（预期分子量为109 kD）。

图1 HLTFec蛋白的纯化Fig 1 Purification of HLTFec protein

2.2 重组HLTF的ATP水解酶活性在没有双链DNA时HLTFec只有非常小的ATP水解酶活性，而当双链DNA存在时该活性被强烈地促进超过300倍（图2）。数据分析显示当双链DNA存在时，该活性的激活常数（Ka）为（81.4±14.1）nmol/L，该反应的最大反应比速率（定义为最大反应速率除以HLTF的浓度，Vmax）为（4.3±0.2）/min。这些数据表明，HLTFec具有强大的受双链DNA激活的ATP酶活性，与其催化复制叉退行的功能一致。

图2 DNA激活的HLTFec的ATP酶活性Fig 2 DNA-stimulated ATPase activity of HLTFec

2.3 重组HLTF的泛素连接酶活性HLTFec可强烈地促进泛素激活酶与Ubc13-Mms2复合物催化的自由泛素链的形成（图3），说明其具有很强的泛素连接酶活性。笔者发现加入双链DNA或单链DNA会进一步促进泛素链的形成。这些数据表明，HLTFec具有较强的泛素连接酶活性，且可被DNA激活。

图3 HLTFec促进Ubc13-Mms2复合物催化自由泛素链形成Fig3 Stimulation of free ubiquitin chain formation catalyzed by Ubc13-Mms2 complex through HLTFec

2.4 重组HLTF催化PCNA泛素链标记的活性该反应需要单泛素化的PCNA作为底物，在该底物中泛素以共价键连接在PCNA的164号位赖氨酸的侧链上。本研究使用类似的泛素-PCNA融合蛋白作为底物检测HLTFec是否能催化PCNA的泛素链标记。结果表明，HLTFec可与Mms2、Ubc13、泛素激活酶等蛋白协作，在泛素-PCNA融合蛋白底物上催化PCNA的泛素链标记（图4）。这些数据表明，HLTFec可催化PCNA的泛素链标记，且对底物中泛素与PCNA的连接方式不敏感。

图4 HLTFec催化PCNA的泛素链标记Fig 4 PCNA-anchored poly-ubiquitination by HLTFec

3 讨论

在常用的蛋白表达系统中，细菌表达系统所需要的工作量和材料最少[23-24]。然而，由于真核生物和细菌在密码子偏好性上存在差异，真核生物的蛋白一般无法很好地在细菌中表达[20-21]。此外，由于细菌与真核细胞中的蛋白折叠环境有很大的不同，一些真核生物的蛋白即使能在细菌中表达，也可能无法正确折叠从而缺乏生物活性[19]。在细菌中表达来自高等真核生物的大分子量多结构域蛋白尤其困难。大分子量多结构域的人源HLTF蛋白在细胞的DNA复制压力应对中发挥关键作用，对它的结构和功能研究急需建立大规模制备高纯度、折叠正确的HLTF的方法。本课题组前期的工作表明，通过优化密码子偏好性可以在大肠杆菌中表达HLTF。本研究优化了从大肠杆菌中制备HLTF的方案，建立了一个有效的制备大量、高纯度的HLTF的方法。更为重要的是，体外实验表明制备的HLTF具有完整的生物活性，提示它是正确折叠的。已有报道表明HLTF可以使用酵母表达系统表达[8]。该系统较为耗时，转化、细胞培养及诱导蛋白表达需2周左右的时间。另外，研究人员仅利用该系统纯化了少量的HLTF进行功能实验，能否将该系统用于制备结构研究所需的大量、高纯度、正确折叠的HLTF还不清楚。与该方法相比，本研究建立的方法耗时更短，细胞培养和诱导蛋白表达仅需2 d。而且，此方法可以方便的制备5～6 mg的高纯度、正确折叠的HLTF。因此，本研究提供了一个有效的方案来制备正确折叠的HLTF蛋白，为该蛋白的结构和功能研究奠定了基础。

HLTF催化PCNA的泛素链标记反应以单泛素化的PCNA作为底物，其生成需要Rad18、Rad6、PCNA和复制因子C（replication factor C，RFC）将PCNA加载到双链DNA上[8，25]。HLTF的酵母同源蛋白Rad5催化类似的反应，也需要一组相似的蛋白因子[26]。然而，研究表明Rad5对泛素与PCNA之间的连接方式并不敏感，可以将泛素-PCNA融合蛋白作为底物来催化PCNA的泛素链标记。本研究发现HLTF同样对泛素与PCNA之间的连接方式不敏感，泛素-PCNA融合蛋白也可作为HLTF催化PCNA泛素链标记反应的底物。本课题组最近发现，Rad5和HLTF以截然不同的机制催化PCNA的泛素链标记。Rad5通过其HIRAN结构域招募PCNA并对其泛素化，而HLTF的HIRAN结构域与PCNA没有相互作用[18]。有意思的是，本研究表明，HLTF和Rad5催化的差异巨大的PCNA的泛素链标记反应对泛素-PCNA连接方式均不敏感。这一发现为深入理解Rad5和HLTF催化的PCNA泛素链标记反应的机制提供线索，也提供一种操作简便的实验体系来研究HLTF催化的PCNA泛素链标记反应。