段 晨，尹 聪，李 凡，张枫琳，马泽炜，凌明发，江青艳，束 刚，王松波

（华南农业大学动物科学学院，广东省动物营养调控重点实验室，广东广州 510642）

肌内脂肪含量是决定畜禽肉品质的重要部分，与肉的风味、水分含量以及嫩度息息相关。而从人类医学角度出发，骨骼肌过量的脂肪沉积会对肌肉的氧化应激和炎症反应起到调节作用，进而导致胰岛素抵抗。因此，研究肌内脂肪沉积和氧化代谢对于畜牧业生产和人类代谢疾病的研究均具有重要意义。肌内脂肪的含量受到品种、性别和营养等多种因素的调控，其中日粮中营养物质对肌内脂肪的沉积起着重要的调控作用。共轭亚油酸自从被发现以来，在抗癌症、抗肥胖和抗炎症等各个方面都发挥了重要的作用。但是，共轭亚油酸的双键在碳链上有多种位置排列方式，种类十分丰富，不同异构体的生理功能不同。共轭亚油酸对于肌内脂肪沉积具有积极作用。研究发现，共轭亚油酸可以增加猪和肉牛的肌内脂肪含量，但试验中大多使用的是共轭亚油酸混合物。目前，已有近30种共轭亚油酸的异构体被发现，其中顺9反11共轭亚油酸（c9,t11-CLA）、反10顺12共轭亚油酸（t10,c12-CLA）2种最主要的共轭亚油酸异构体，但其对于肌内脂肪沉积的影响机制尚不清楚。

本试验选取c9,t11-CLA和t10,c12-CLA异构体对小鼠进行饲喂，探索肌内脂肪含量变化导致的线粒体代谢变化，旨在初步探索共轭亚油酸异构体影响肌内脂肪沉积的作用机制，为畜牧生产上肉品质调控及人类医学的胰岛素抵抗提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计及日粮 3周龄SPF级C57BL/6J公鼠和维持日粮均购于广东省医学动物实验中心。将成长至5周龄的公鼠按体重分成3组，每组8只，分组后所有小鼠采食对照组饲料适应1周后，对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂添加2%的顺9反11共轭亚油酸（c9,t11-CLA）和添加2%的反10顺12共轭亚油酸（t10,c12-CLA）的日粮，试验期3周。共轭亚油酸异构体（纯度44%）为武汉祥和顺达公司产品。共轭亚油酸异构体以2%的浓度通过等能替换豆油的方式加入日粮中，基础日粮组成及营养成分见表1。

表1 基础日粮组成及营养成分（干物质基础）

1.2 测定指标及方法

1.2.1 体重、采食量、体组成 每周称量小鼠体重、给料和剩料料重，计算采食量。饲喂3周后使用体组成仪器检测所有小鼠体组成。

1.2.2 血清甘油三酯和游离脂肪酸 小鼠饲养试验及体组成检测完成后，对所有小鼠进行眼球采血，采血完成后离心（3 000 r/min，15 min）得到血清，按照试剂盒（南京建成生物工程有限公司）说明书检测小鼠血清甘油三酯和游离脂肪酸含量。

1.2.3 肌肉采集、肌肉甘油三酯含量测定和油红O染色血液收集完成后，打开皮肤，暴露、分离腓肠肌和比目鱼肌，左腿为分子样，用于甘油三酯含量检测；右腿使用硬纸片贴片固定后放入液氮，-80℃保存。切片前置于冰冻切片机平衡2 h后，使用粘附性载玻片贴片，进行油红O染色（染色剂货号：O1391，Sigma-Aldrich公司），显微镜下观察并拍照，使用Image J软件进行灰度统计。

1.2.4 组织RNA抽提和荧光定量PCR检测 小鼠腓肠肌的总RNA按照HiPure Total RNA Mini kit试剂盒（广州美基生物科技有限公司）说明书进行抽提。抽提完成后进行反转录，得到的cDNA样品稀释5倍后进行荧光定量PCR检测。引物合成自上海生工生物工程股份有限公司，引物序列见表2。

表2 引物序列

1.4 统计分析 采用GraphPad Prism软件作图和分析结果，通过单因素方差分析的Duncan′s新复极差法进行显著性检验，＜0.05为显著性判定标准。数据结果用平均值±标准误表示。

2 结果

2.1 2种共轭亚油酸异构体对小鼠体重、采食量、体组成的影响 如图1所示，日粮添加2种共轭亚油酸异构体均可以降低小鼠体重和采食量（＜0.05），增加小鼠的肌肉百分比（＜0.05），降低脂肪百分比（＜0.05）。

图1 2种共轭亚油酸异构体对小鼠体重（A）、采食量（B）、体组成（C、D）的影响

2.2 2种共轭亚油酸异构体对小鼠血清甘油三酯和血清游离脂肪酸含量的影响 由图2可见，2种共轭亚油酸异构体均可降低小鼠血清甘油三酯含量（＜0.05）；日粮添加t10,c12-CLA可增加血清游离脂肪酸含量（＜0.05），而c9,t11-CLA有一定促进作用，但达不到显著水平（＞0.05）。

图2 2种共轭亚油酸异构体对小鼠血清甘油三酯（A）和游离脂肪酸（B）含量的影响

2.3 2种共轭亚油酸异构体对小鼠腓肠肌、比目鱼肌甘油三酯含量以及腓肠肌肌内脂肪含量的影响 由图3A可见，t10,c12-CLA可以增加小鼠腓肠肌、比目鱼肌的甘油三酯含量（＜0.05），而饲喂c9,t11-CLA与对照组无显著差异。由于饲喂t10,c12-CLA小鼠肌肉部位甘油三酯含量升高，进一步对小鼠腓肠肌冰冻切片进行油红O染色（图3B）。统计结果显示，日粮添加t10,c12-CLA可以增加小鼠腓肠肌肌内脂肪含量（＜0.05），而饲喂c9,t11-CLA与对照组无显著差异（图3C）。

图3 2种共轭亚油酸异构体对小鼠腓肠肌、比目鱼肌甘油三酯（A）含量以及腓肠肌肌内脂肪含量（B、C）的影响

2.4 2种共轭亚油酸异构体对小鼠腓肠肌脂肪酸转运载体mRNA表达的影响 饲喂t10,c12-CLA可降低小鼠血清甘油三酯含量，而肌肉部位甘油三酯以及肌内脂肪含量均升高（＜0.05）。为探究这一作用是不是由于血清中的甘油三酯转移进入肌肉，对小鼠腓肠肌中的脂肪酸转运载体mRNA表达进行检测。由图4可见，脂肪酸转运蛋白1和4的基因表达均增加（＜0.05），提示有可能是由于脂肪酸转运增加导致血清甘油三酯减少，而肌肉部位甘油三酯和脂肪的沉积增多。

图4 2种共轭亚油酸异构体对小鼠腓肠肌脂肪酸转运载体mRNA表达的影响

2.5 2种共轭亚油酸异构体对小鼠腓肠肌线粒体生物合成和氧化代谢相关基因mRNA表达的影响 由图5可知，日粮添加t10,c12-CLA可以增加小鼠腓肠肌线粒体生物合成和氧化代谢相关基因的mRNA表达（＜0.05），而c9,t11-CLA则没有这一作用。

图5 2种共轭亚油酸异构体对小鼠腓肠肌线粒体生物合成（A）和氧化代谢（B）相关mRNA表达的影响

3 讨 论

3.1 2种共轭亚油酸异构体对小鼠肌内脂肪含量、线粒体生物合成和氧化代谢的影响 相关研究表明，日粮添加共轭亚油酸饲喂60 d可以导致牛的皮下脂肪含量显著降低，而肌内脂肪含量显著升高；日粮添加共轭亚油酸也可显著提高猪的肌内脂肪含量。本研究发现，日粮添加t10,c12-CLA可以导致小鼠肌内脂肪含量的升高。这提示共轭亚油酸混合物增加肌内脂肪可能只是t10,c12-CLA异构体在发挥着这一作用，而且这种作用产生的原因是由于t10,c12-CLA导致肌肉部位脂肪酸转运载体表达增加，促使更多的脂肪酸转运进入肌肉部位，但具体机制尚需进一步研究。

相关研究表明，饲喂共轭亚油酸混合物可以增加小鼠机体的基础代谢，肝脏部位脂肪沉积增多，而这种肝脏脂肪的增加伴随着胰岛素抵抗现象，进一步研究表明肝脏部位UCP2蛋白表达和代谢同样显著增加。与肝脏相同，肌肉作为能量代谢组织，脂肪同样通过异位沉积进入肌肉储存也就变得容易接受。此外，骨骼肌增加脂肪酸摄取会导致过量的脂肪沉积和生物活性脂质介质的生成，这些介质可能对肌肉的氧化应激和炎症反应起到调节作用。本研究发现，日粮添加t10,c12-CLA可以导致肌肉部位线粒体生物合成和氧化代谢的基因表达升高，看似与肌内脂肪增加的表型不符，但是肌肉部位这种代谢的增加首先与机体代谢增加相吻合，其次也与骨骼肌在脂肪酸摄取增多之后产生的一种适应性变化相吻合，即肌内脂肪沉积增多，而肌肉组织试图通过代谢来抵抗这种变化。但是最终小鼠肌内脂肪沉积增多，可能是由于脂肪酸转运载体转运进入肌肉的脂肪酸多于肌肉代谢消耗的脂肪酸，进而导致过多的脂肪酸以肌内脂肪的形式沉积下来。

3.2 共轭亚油酸不同异构体发挥的作用异同以及t10,c12-CLA对肌肉作用的可能机制 在本研究中，2种共轭亚油酸异构体均可降低小鼠体重和脂肪比例、增加小鼠肌肉比例以及血清甘油三酯含量，而仅t10,c12-CLA在肌内脂肪沉积、线粒体生物合成和氧化代谢方面具有显著作用。不同共轭亚油酸异构体在机体内产生相同或者不同的生理功能已有相关报道。如t10,c12-CLA对于肥胖小鼠减脂的影响与限饲作用相同，主要原因在于影响脂肪的周转，而c9,t11-CLA没有这一作用；在胰岛素抵抗小鼠上，饲喂添加2种不同共轭亚油酸异构体的日粮，同样对小鼠的体组成产生了相反的作用。而在细胞上，共轭亚油酸异构体对于3T3-L1脂肪前体细胞分化的作用也完全不同。在分化前期，2种异构体都可以促进分化，但是到了分化后期，t10,c12-CLA的作用变为抑制，而c9,t11-CLA的作用没有发生变化。以上研究表明，c9,t11-CLA和t10,c12-CLA异构体虽然只是1个双键位置发生了变化，但可能导致了生理功能产生极大差异，这也在本研究中得到了进一步证实。

本研究还发现，饲喂t10,c12-CLA可以导致小鼠机体脂肪组织脂肪含量降低，肌内脂肪含量增加，这是由于共轭亚油酸增加了肌肉部位脂肪酸转运载体表达，进而增加了脂肪酸向肌肉的转运。对于脂肪组织，t10,c12-CLA可能通过促进代谢和脂肪分解等过程来降低脂肪沉积。但肌肉部位脂肪形成受到一些旁分泌因子的调控作用，如在运动之后褐色脂肪会产生脂质因子12,13-diHOME，进而促进肌肉组织脂肪酸摄取；支链氨基酸代谢产物3-HIB可以通过促进肌肉部位内皮细胞的脂肪酸吸收和转运，进而促进肌内脂肪沉积。t10,c12-CLA导致不同部位脂肪沉积出现差异，降低皮下脂肪含量，而增加肌内脂肪含量，这种来源于肌肉内的旁分泌中间代谢产物对于跨膜脂肪酸的调配作用可为后续研究提供一个合理的方向。至于t10,c12-CLA是否是通过促进某种具备调控作用的旁分泌因子生成而导致了肌肉部位脂肪沉积的增多，需要更进一步研究。

4 结 论

本研究结果表明，与c9,t11-CLA相比，t10,c12-CLA在肌内脂肪沉积、肌肉部位线粒体生物合成和氧化代谢方面发挥着更显著的作用。