张华婷， 尹迪， 陈一欢， 龚小慧， 裘刚， 胡勇

新生儿窒息是指由于产前、产时或产后的各种病因使新生儿出生后不能建立正常呼吸，患儿处于缺氧状态，从而引起全身多脏器损害，是围产期新生儿死亡和致残的主要原因之一[1]。围产期窒息患儿早期胃肠道供血供氧受限，多有胃肠道功能紊乱，出现喂养不耐受、腹胀、肠鸣音减弱或消失等，甚至并发新生儿坏死性小肠结肠炎可能，一旦发生胃肠功能衰竭，病死率高，严重威胁新生儿健康。而新生儿肠道菌群早期定植对胃肠功能健康发育至关重要，但目前窒息患儿胃肠功能紊乱与肠道菌群相关性尚不明确，窒息患儿肠道菌群目前研究报道并不多。本研究旨在检测窒息患儿粪便肠道菌群，探讨窒息患儿肠道菌群早期定植与胃肠功能紊乱的相关性，分析新生儿窒息患儿肠道微生态特征及临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2019年1～6月在上海交通大学附属儿童医院住院治疗的新生儿窒息患儿7例为研究对象，为窒息组，其中男5例，女2例；胎龄平均(279±11)d；体质量平均(3 147±381)g；顺产4例，剖宫产3例。同期选取我院健康新生儿11例为正常对照组，其中男7例，女4例；胎龄平均(277±8)d；体质量平均(3 253±451)g；顺产6例，剖宫产5例。两组研究对象性别、胎龄、体质量、出生方式比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准 参照《新生儿窒息诊断的专家共识》中新生儿窒息的诊断标准[2]。(1)Apgar评分1 min<7分，或5 min<7分，伴脐动脉血pH<7.2；(2)未取得脐动脉血气分析结果的，Apgar评分<7分。

1.3 纳入标准 (1)符合新生儿窒息的诊断标准；(2)足月出生，年龄0～3 d；(3)生后配方奶或配方奶为主喂养；(4)无抗生素及微生态制剂使用史；(5)本研究通过我院医学伦理委员会审查，家属均知情同意。

1.4 排除标准 (1)存在严重消化道畸形患儿；(2)存在遗传代谢性疾病。

1.5 研究方法 采用无菌粪便收集盒收集入组患儿生后72 h内粪便标本，并立即保存到-20 ℃冰箱待进一步检测及研究。为检测粪便菌群分型，将采集的粪便样本经过预实验处理经过DNA提取、PCR扩增、纯化、混样、建库及检测后，通过IlluminaMiseq/Hiseq高通量测序平台进行16S rRNA测序，将得到的数据Raw Reads经过质量过滤得到可靠的Clean Reads，并基于Overlap进行拼接得到Clean Tags，进而进行数据分析。

2 结果

2.1 肠道菌群多样性分析比较 通过QIIME软件分析所测菌群序列，对窒息组与正常对照组间菌群α多样性指数分析，结果显示窒息组Evenness多样性指数显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。同时基于OTU丰度对两组菌群β多样性分析，主成分分析显示出窒息组与正常对照组间菌群结构差异不显著(P=0.142)，见图2。

图1 两组间α多样性指数分析

2.2 肠道菌群门、属水平分类学组成分析 在两组粪便样本中菌群门水平主要以变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、拟杆菌门以及放线菌门五个门含量相对丰富，进一步分析菌群属水平成分，并检测到相对丰度高的15个菌属，通过LDA聚类分析，对照组新生儿粪便中检测到厚壁菌门中兼性厌氧菌属相对丰度较高，包括孪生球菌属(Gemella)、颗粒链球菌(Granulicatella)、肉杆菌科属(Carnobacteriacae)，此外变形菌门中菌包括嗜血菌属(Haemophilus)、巴斯德菌科属(Pasteurellaceae)的含量亦相对较高。而新生儿窒息患儿粪便中检测以厌氧厚壁菌门菌属为主，包括梭菌属(Clostridiaceae)、韦荣球菌属(Veillonella)、月形单胞菌属(Selenomonas)、厌氧棍状菌属(Ananerotruncus)，以及变形菌门的包希氏菌属(Bosea)等，见图3(封三)。

3 讨论

新生儿窒息是围产儿常见的出生后疾病之一，窒息缺氧早期患儿通过潜水反射，机体血流重新分布，优先保证脑、心脏等重要脏器的血氧供应，而胃肠道、肾脏等非重要器官血流灌注明显减少[3]，从而造成脏器损伤。随着窒息加重，缺血缺氧、酸中毒也随之加重，2016年我国一项新生儿窒息多中心研究发现，窒息特别是重度窒息患儿胃肠功能损害可达22.4%[4]，对新生儿早期胃肠功能完善，以及胃肠黏膜免疫的建立产生不可忽视的影响。

人体肠道内所有菌群及其代谢产物构成一个庞大而复杂的微生态系统，参与人体各项生理功能及代谢[5]。婴幼儿时期是肠道菌群建立与发展的最为重要的时期，也易受环境因素、饮食结构、抗生素等影响。婴幼儿时期肠道菌群的功能与各系统功能发育同步进行，包括参与胃肠功能、促进免疫功能发育、抑制炎症反应等。目前研究在母亲宫内无菌与否上尚有争议[6]，但多项研究证实肠道菌群自出生即开始定植[1,7]。新生儿生后细菌很快从口、鼻、肛门上下两端侵入，至第3天接近高峰。早期胃肠道内氧气相对充足，兼性厌氧菌优先定植，包括大肠埃希菌、肠球菌。随后逐步过渡为双歧杆菌、拟杆菌、梭菌属等占主导[8]，影响胃肠道的发育成熟，一方面参与机体复杂碳水化合物的代谢，也可以通过生物拮抗影响致病菌的定植与繁殖。

肠道菌群多样性可以反应菌群的丰度和种类特征，菌群分布合理对维持肠道内环境稳态十分重要。研究表明使用抗生素可显著降低肠道菌群多样性[9]，新生儿期抗生素的使用可延缓肠道菌群的建立，使致病菌易于定植，引起抗生素相关性腹泻等，而适当补充益生菌可能通过恢复肠道微生态平衡改善胃肠道症状[10]。研究表明健康新生儿出生时粪便菌群主要以兼性厌氧菌肠杆菌科定植为主[11]，本研究中对照组新生儿粪便优势菌群为兼性厌氧厚壁菌门的菌属，符合新生儿早期肠道菌群特征，这与既往研究结果一致。与窒息组患儿相比Evenness多样性指数降低，窒息组患儿菌群中除兼性厌氧菌外，厌氧菌也明显富集。这可能与健康患儿生后肠内氧气相对丰富，致使厌氧菌难以定植有关。

本研究发现对照组新生儿肠道优势菌以厚壁菌门为主，包括孪生球菌属、颗粒链球菌、肉杆菌科属，此外变形菌门中菌包括嗜血菌属、巴斯德菌科属，均为新生儿生后肠道菌群早期常见定植菌[11]，这些肠道菌群可以通过发酵碳水化合物后均可产生短链脂肪酸[12-13]，参与肠道黏膜屏障功能发育[14]。而新生儿窒息组患儿优势菌则为梭菌属、韦荣球菌属、月形单胞菌属、厌氧棍状菌属以及包希菌属。证实了窒息患儿生后早期肠道菌群差异性改变，与窒息患儿早期胃肠道内缺血缺氧，可致使胃肠黏膜炎症反应，对菌群定植产生影响，进一步影响胃肠黏膜屏障发育成熟。有研究表明，仔猪坏死性小肠结肠炎肠黏膜可检测到大量梭菌属[15]。此外本研究发现两组患儿双歧杆菌含量并不占优势，既往研究表明双歧杆菌定植与母乳喂养显著相关，且多于生后第2天开始定植，于生后4～5 d后开始占主导地位[16]，故而早期检测时并不占优势。此外也可能与两组患儿入组时喂养均以配方奶或配方奶为主喂养，致使双歧杆菌定植延迟。

通过本实验我们初步分析了新生儿窒息患儿肠道菌群特征，证实了新生儿窒息患儿早期肠道菌群定植与健康新生儿存在显著差异。间接证实了窒息与新生儿早期肠道菌群定植存在相关性，可能影响新生儿早期肠道菌群多样性以及优势菌属种类。这可能是窒息患儿胃肠功能紊乱的发病机制之一，进一步通过肠道菌群代谢产物对新生儿疾病的发生发展产生一定的影响。但本实验样本量偏小，且采样点单一，不能系统比较新生儿窒息患儿肠道菌群的动态变化，未来可进一步加大样本量，增加采样点，以更好地揭示新生儿窒息患儿早期肠道微生态特点。