彭青，卢云浩，何强

(四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065)

亚硝酸盐作为防腐剂和发色剂被广泛应用于肉制品加工，当以活性亚硝酸和一氧化氮形式存在时，与次级胺类物质生成具有强致癌性的亚硝胺类化合物[1]；自由基在人体代谢中失衡时，同样会导致人体正常细胞和组织损坏，引起多种疾病，而对人体健康产生危害[2]。研究表明，维生素、酚类、类黄酮等天然抗氧化剂可清除自由基或抑制电子传递，并能有效阻断亚硝酸根与仲胺的结合生成N-亚硝胺[3-4]，从而有益人体健康。此外, 不同抗氧化剂之间存在一定的协同效应, 按不同比例将单一的抗氧化剂混合使用可以达到更理想的抗氧化效果[5]。

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)和辣椒(CapsicumannuumL.)广泛分布于中国西南等地，作为传统的药食两用香辛料，被大量混合使用于餐桌调味。研究发现花椒、辣椒中富含生物碱、多酚、辣椒素、类胡萝卜素等多种生物活性成分，具有抗癌、抗氧化、抗菌等多种药理作用[6-9]。目前，对于两者联合使用的抗氧化能力尚不明确。因此，本研究基于花椒和辣椒饮食的烹饪工艺，采用不同的浸提工艺提取两者的活性物质，基于NO2-·、DPPH·、ABTS+·自由基体外清除模型，探讨了花椒和辣椒协同抗氧化的作用效果，以期为合理搭配花椒与辣椒用于食品抗氧化以及人体健康提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

汉源红花椒、红辣椒：购于当地超市；磺胺、盐酸萘乙二胺、DPPH、ABTS：购自Sigma公司(中国上海)；亚硝酸钠、过硫酸钾：购自成都科龙化工试剂厂；UV2000紫外可见分光光度计：尤尼柯仪器有限公司；SOQ电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；KQ3200DE超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 花椒-辣椒水提取物(ZCW)制备

原料经粉碎过40目筛后，分别称取30 g花椒粉、辣椒粉、混合粉末(2∶1,W/W)于1000 mL沸水中蒸煮2 h，离心，然后将上清液旋蒸并用蒸馏水定容到100 mL容量瓶中，分别得到花椒水提物(ZW)、辣椒水提物(CW)和花椒-辣椒混合水提物(ZCW)。

1.2.2 花椒-辣椒醇提取物(ZCE)制备

原料经粉碎过40目筛后，分别称取30 g花椒粉、辣椒粉、混合粉末(2∶1,W/W)于1000 mL无水乙醇中加热回流提取2 h，离心，然后将上清液旋蒸并用乙醇定容到100 mL容量瓶中，得到花椒醇提物(ZE)、辣椒醇提物(CE)和花椒-辣椒混合醇提物(ZCE)。

1.3 亚硝酸盐清除能力测定

亚硝酸盐清除能力的测定采用Griess reagent法[10]。取1 mL稀释至一系列浓度梯度的提取样液(0.2～1 mg/mL)与1 mL 1 mmol/L NaNO2和8 mLpH 3.0的柠檬酸钠缓冲液混合，于37 ℃水浴中反应2 h，得试样反应液，不加提取物作为对照组。取1 mL试样反应液加入1.5 mL Griess I试剂(磺胺5 g/L)于室温反应5 min后，加入1.5 mL Griess II试剂(盐酸萘乙二胺1 g/L)于室温继续反应5 min，于538 nm处测定吸光度。

亚硝酸盐清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%。

式中：A0为对照组吸光度，A1为实验组吸光度。

1.4 DPPH自由基清除能力测定

配制DPPH自由基工作液[11]，取2 mL稀释至一系列浓度梯度的提取物(0.02～0.1 mg/mL)与2 mL DPPH溶液混合，在25 ℃避光孵育30 min，于517 nm处测定反应液的吸光度，以95%乙醇代替提取物做空白对照。DPPH自由基清除率的计算同1.3。

1.5 ABTS自由基清除能力测定

配制ABTS自由基工作液，取0.1 mL稀释至一系列浓度梯度的提取物(0.2～1 mg/mL)同3.9 mL ABTS自由基工作液混合，在25 ℃条件下孵育6 min，于734 nm处测定反应液的吸光度，以纯水代替提取液做空白对照。ABTS自由基清除率同1.3。

1.6 花椒和辣椒提取物协同抗氧化效果评价

本文采用Chou-Talalay法对花椒和辣椒提取物协同抗氧化效果进行评价[12]。

1.6.1 中值效应方程

中效方程：Fa/Fu=(D/Dm)m。

式中：D为药物浓度；Fa为D浓度下物质的清除率；Fu=1-Fa；Dm为中效浓度(IC50)，是清除率50%时的浓度；m为量效关系曲线的系数。

1.6.2 联合指数(CI)

将中值效应方程应用到两种物质的联合使用，Chou和Talalay提出联合指数CI来量化两种物质的协同或拮抗作用:

式中：D1、D2为联合使用时产生清除率X效应两物质各自所需剂量。Dx1、Dx2为两物质单用时产生清除率X效应各自剂量。CI=1，CI<1和CI>1分别表示两物质具有相加作用、协同作用、拮抗作用。

1.6.3 剂量减少指数(DRI)

物质联合使用前后的剂量变化幅度是评价联合使用效果的重要指标，用来衡量相同作用水平下，协同使用时相比单独使用时每种物质剂量降低的倍数。

1.7 数据处理

采用SPSS 24.0进行数据分析，其中方差分析采用单因素-邓肯分析，Origin 2018绘图。

2 结果与分析

2.1 提取物对NO2-·、DPPH·和ABTS+·的清除效果比较

各提取物对NO2-·、DPPH·和 ABTS+·的清除能力及IC50值见图1和表1。

表1 各提取物清除NO2-·、 DPPH·和ABTS+·自由基的IC50值Table 1 IC50 values of extracts scavenging NO2-·,DPPH·and ABTS+ ·free radicals

图1 提取物对NO2-·(a)、DPPH·(b)和ABTS+·(c)清除浓度-效应图Fig.1 The scavenging concentration-effect diagram of extracts on NO2-·(a), DPPH·(b) and ABTS+·(c)

由图1可知，各提取物对NO2-·、DPPH·和ABTS+·的清除能力呈一定的量效关系，清除效果均随浓度增大而增大，表明各提取物均具有良好的抗氧化活性，且醇提物的抗氧化活性优于水提物。在亚硝酸盐体系中，单独使用花椒水提物ZW(400 μg/mL)和辣椒水提物CW(200 μg/mL)的清除率分别为46.23%和10.39%，而联合花椒-辣椒水提取物ZCW(600 μg/mL)的清除率为65.88%，大于两者单独作用之和，且优于600 μg/mL ZW的单独作用(50.76%)，说明混合使用花椒和辣椒(2∶1,W/W)对亚硝酸盐的清除效果更显著，呈现协同作用。DPPH·和ABTS+·体系中呈现出了类似的结果。

由表1可知，各提取物的抗氧化能力存在显著性差异(p<0.05)，在NO2-·和DPPH·清除体系中，各提取物抗氧化活性强弱为ZCE>ZCW>ZE>ZW>CE>CW；ABTS自由基体系中为ZCE>ZE>ZCW>ZW>CE>CW。

2.2 联合提取物ZCW和ZCE对NO2-·、DPPH·和ABTS+·清除效果相互作用分析

联合指数CI是用于评价物质间的相互作用最简便可行的定量方法，CI<1物质间呈协同作用，反之，呈拮抗作用。在NO2-·、DPPH·和ABTS+·清除体系中，ZW和CW、ZE和CE在低浓度时(清除率小于10%时)呈现拮抗作用；而当清除率大于10%时，联合水提物和醇提物均具有协同清除NO2-·、DPPH·和ABTS+·的作用(见图2中 a～c)。

图2 ZCW、ZCE对NO2-·(a)、DPPH·(b)和ABTS+·(c)清除相互作用联合指数图Fig.2 The combined index diagram of interactions of ZCW and ZCE scavenging NO2-·(a), DPPH·(b) and ABTS+·(c)

低浓度时，体系中抗氧化剂的氢原子与极性溶剂或其中一些抗氧化剂形成氢键，使得周围的氢原子产生两个膨胀的杂原子，导致空间大量堵塞，其他游离的抗氧化剂无法接触和清除自由基，从而产生拮抗作用[13]。此外，由图2可知，随着清除效果的增加，CI值呈逐渐降低的趋势，表明随着浓度增加，混合提取物的协同作用越强。且在NO2-·、DPPH·体系中，ZCE的协同抗氧化效果较ZCW强，而ABTS+·体系中则相反。推测是界面效应引起的，ABTS+·是水溶性自由基，花椒-辣椒联合水提物和ABTS聚集形成双水界面，醇提物则可能由于溶剂效应，影响分子间排列的有序性，没有与ABTS形成良好的双水界面，而与脂溶性自由基DPPH形成油油界面，与NO2-·形成油水界面，达到协同抗氧化效果。

根据表1结果以及剂量效应关系绘制等效应图，横轴分别标记花椒提取物清除效应为50%、75%、90%的浓度值(ED50、ED75、ED90)，纵轴分别标记辣椒提取物达到相应清除效应的浓度值(ED50、ED75、ED90)，连接两两浓度值构成相加线，当花椒-辣椒联合提取物达到相应清除效应的剂量浓度在相加线下方，表明联合提取物具有协同作用；处于相加线上表示加和作用；处于相加线上方表示拮抗作用。

由图3可知，NO2-·、DPPH·和ABTS+·清除体系中，当花椒-辣椒联合提取物清除效应为50%、75%和90%时，联合提取物ZCW(见图3中a～c)和ZCE(见图3中A～C)数据点均落在了斜边之下，进一步说明联合使用呈现协同抗氧化效果。原因可能是花椒-辣椒联合提取物中的维生素C再生了槲皮素或芦丁，从而使体系形成一个循环的氧化还原系统；辣椒素能够再生维生素E、酚酸氧化偶联类胡萝卜素，使得整个体系的抗氧化能力增强，达到协同抗氧化效果[14-15]。且可以从图3中看到在达到相同清除效果条件下花椒-辣椒联合提取物的使用剂量低于花椒和辣椒单独提取物的使用剂量。

图3 ZCW和ZCE对NO2-·(a和A)、DPPH·(b和B)和ABTS+·(c和C)清除等效应图

2.3 提取物对NO2-·、DPPH·和ABTS+·清除效果剂量减少指数

DRI值越大，说明联合使用时该物质的使用剂量降低程度越明显，同时也降低该物质对机体的毒性。由图4中a可知，亚硝酸盐体系中，CW的log DRI高于ZW的log DRI，说明联合使用ZCW中CW的单一用量减少程度较ZW明显；而随着作用效果的增加，其log DRI在减少，说明其单一用量减少程度不呈增大的趋势；由图4中A可知，ZE和CE的log DRI均随作用效果的增加而增大，说明联合使用ZCE中，ZE和CE的单一用量减少程度呈增大的趋势，且CE的减少程度较ZE明显。

图4 ZCW和ZCE对NO2-·(a和A)、DPPH·(b和B)和ABTS+·(c和C)清除效应与剂量减少指数对数图Fig.4 Fa-log DRI plots of ZCW and ZCE scavenging NO2-·(a and A),DPPH·(b and B) and ABTS+·(c and C)

DPPH自由基清除体系中，CW、ZW的log DRI均大于0，且CW的log DRI随着作用效果增大不断增大，说明ZCW联合使用提取物中对CW的用量减少倍数比较明显(见图4中b)。ZE和CE的log DRI均稳定在0.5和0.25附近，但CE的log DRI大于ZE，说明联合使用的ZCE提取物对CE的使用量减少程度较ZE大(见图4中B)。

ABTS自由基清除体系中，CW的log DRI大于ZW的log DRI，并随着清除效应增大而缓慢上升，说明联合使用中CW的用量减少程度较ZW明显(见图4中c)。ZE和CE的log DRI均随清除能力的增加而增加，说明在ABTS体系中，CE和ZE的使用量在联合使用中均一定程度地减少(见图4中C)。以上分析进一步说明花椒和辣椒提取物具有协同抗氧化效果。

3 结果

本研究发现花椒和辣椒的醇提取物和水提取物对亚硝酸盐、DPPH和ABTS自由基清除活性存在较大差异，花椒和辣椒醇提取物的清除活性分别优于水提取物，当对两者进行配比联合提取后，表现出了一定程度的协同抗氧化作用，且在不同的抗氧化体系中，花椒-辣椒联合水提物和醇提取物的协同抗氧化效果不一。研究为食品加工领域对于亚硝酸盐的清除和典型香辛料的联合使用提供一定指导，奠定科学基础。