李穗君，费永涛，郑 茵，李 理，3*

（1 华南理工大学食品科学与工程学院 广州 510640 2 仲恺农业工程学院 广州 510225 3 中新国际联合研究院 广州 510700）

豆腐乳清是豆腐制作过程中产生的黄色沥水，俗称豆腐黄浆水，通常每加工处理1 t 大豆产生4～5 t 的豆腐乳清。豆腐乳清含有丰富的低聚糖、蛋白质、异黄酮等营养物质，直接排放往往产生很高的BOD 和COD[1]，不仅造成极大的资源浪费，还带来严重的环境污染。如何对豆腐乳清进行综合开发利用，成为国内外学者关注的问题。目前，国内外学者对豆腐乳清进行了较多的研究。如利用豆腐乳清来进行酱油和醋的配制[2-3]，利用酵母菌发酵豆腐乳清制备酒精饮料[4]，利用乳酸菌发酵豆腐乳清制备饮料[5]。多项研究表明，利用益生菌来发酵豆腐乳清，其抗氧化活性和生物活性得到明显的提高[5-7]。本课题组前期从自然发酵的酸浆水中分离筛选到哈尔滨乳杆菌M1[8]、黏膜乳杆菌M2、发酵乳杆菌M4、鼠李糖乳杆菌C1[9]和解淀粉乳杆菌L6[10]，以及从直投式发酵剂XP1 中分离筛选并在豆浆中驯化得到了嗜热链球菌ST3[11]等，将它们应用于豆腐乳清发酵，结果发现部分菌种能显著改善风味，并提高其生物活性[12]。为了更详尽研究乳酸菌发酵豆腐乳清的代谢作用及其对风味的影响，本文采用上述5 种乳杆菌与嗜热链球菌联合发酵豆腐乳清，应用一维核磁共振氢谱和气相色谱-质谱联用方法分析发酵前、后代谢物种类和含量的变化，探究菌种特性，为豆腐乳清的开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

所用材料：豆腐乳清：广东江门某腐乳厂提供；所用菌株：哈尔滨乳杆菌M1（Lactobacillus hurbimesis M1），黏膜乳杆菌 M2（Lactobacillus mulosae M2），发酵乳杆菌M4（Lactobacillus fermentum M4），鼠李糖乳杆菌C1（Lactobacillus rhamnosus C1），解淀粉乳杆菌L6（Lactobacillus.amylolyticus L6）（保藏号：CGMCC 9090），分离自豆腐酸浆水，嗜热链球菌ST3（Streptococcus thermophilus）（保藏号：CGMCC 11943），从直投式发酵剂XP1 分离并在豆奶中驯化，保存于本实验室，以下简称M1、M2、M4、C1、L6，ST3。

所用试剂：M17 肉汤培养基、MRS 肉汤培养基，购于广州环凯生物科技有限公司；D2O（0.05%tmsp） 分析纯，购于青岛微波腾龙有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平，瑞士梅特勒托利多仪器有限公司；600 M 超导核磁共振波谱仪，德国Bruker 公司；气-质谱联用仪，岛津企业管理有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；电热恒温培养箱，上海申贤恒温设备厂；超净工作台，苏州净化设备厂；真空冷冻干燥机，北京博医康有限公司；恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限公司；固相微萃取装置，美国Supelco 公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备 将乳杆菌M1、M2、M4、C1 和L6 分别接种于50 mL MRS 肉汤培养基中，于37℃条件下培养24 h，同时将ST3 接种于45 mL 的M17 培养基中，于42 ℃条件下培养24 h，在8 000 r/min，4 ℃的条件下离心5 min 获得M1、M2、M4、C1、L6、ST3 菌体，用25 mL 无菌水复溶，冲洗菌体两次。在8 000 r/min，4 ℃条件下离心获得M1、M2、M4、C1、L6、ST3 菌体，使用15 mL 无菌水复溶。将取自腐乳厂的豆腐乳清进行离心，去除沉淀，于121 ℃灭菌15 min，4 ℃冷藏备用。将5 组发酵 剂M1 和ST3、M2 和ST3、M4 和ST3、C1 和ST3、L6 和ST3 按1:1 的比例进行混合，按照2%的接种量分别接入到上述灭菌豆腐乳清中，在37℃下发酵36 h，获得样品。

1.3.2 基于1H NMR 分析豆腐乳清发酵前后代谢产物的变化 核磁共振分析方法参考文献资料[13-14]，略有修改。首先对样品前处理：将各组样品pH 值调至6.0，于8 000 r/min 下离心7 min，取上清液于-20 ℃冰箱预冻24 h，将预冻后的样品置于真空冷冻干燥机中冻干，获得样品的冻干粉末，密封保存待用；然后制备待测样品：将上述制得的各样品冻干粉末溶解于600 μL 含有0.05% Tmsp（内标物） 的D2O 中，混合均匀后转移至5 mm NMR 管中，待检测；核磁检测参数：样品均在600 M 超导核磁共振波谱仪上进行检测；检测频率为600.17 MHz，配备5 mm TXI 反相三共振探头；采样温度为室温，扫描次数128 次，放松延迟（Relaxation Delay）5.000 s，脉冲宽度（Pulse Width）为12.7 μs，采用脉冲序列（Pulse Sequence）NOESYGPPR1D 的预饱和技术实现对水峰信号的完全抑制。

1.3.3 GC-MS 测定发酵豆腐乳清挥发性风味成分 采用固相微萃取气相色谱质谱联用技术（SPME-GC-MS）对发酵前后豆腐乳清的挥发性风味成分进行测定，测定方法参考本课题组前期研究报道[15]，稍做修改。首先对样品进行固相微萃取：用5 mL 移液枪吸取5 mL 样品至20 mL 的顶空进样瓶中，用锡纸和封口胶密封瓶口，在40 ℃下保温10 min 后将萃取头插入进样瓶中，用磁力搅拌器控制搅拌速度为50 r/min，温度40 ℃，萃取30 min。首次使用该萃取头需先在240 ℃老化30 min，防止样品之间交叉污染。

色谱条件：采用岛津 （SHIMADZU GCMSQP2010Ultra）对所有的样品进行检测，使用的是极性色谱柱：Rtx-wax 毛细血管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；萃取头插入后需要在进样口吸3 min；载气使用高纯度的He；进样口温度：240 ℃；流速：1.0 mL/min，不采取分流。程序升温的过程：初始温度为35 ℃，保持此温度3 min，然后以3 ℃/min 的速度升温至80 ℃，再以4 ℃/min 的速度升温至120 ℃，再以10 ℃/min 的速度升温至230℃，保持此温度2 min，整个分析过程的时间为41 min。质谱使用的条件：离子源温度为230 ℃，接口温度为240 ℃，质量扫描范围为35～450 amu，离子源EI 为70 eV。

1.3.4 数据分析和处理 核磁共振检测结果先用Mestrenova（西班牙Mestrelab Research 公司）进行手动矫正相位和基线，化学位移用Tmsp（δ=0）定标，再使用Chenomx NMR（武汉安隆科讯技术有限公司）进行个体代谢物的鉴定和定量分析，得到的结果使用origin 2018 （originlab 公司） 进行分析。

GC-MS 检测结果先用NIST 11s 库进行检索，选取匹配度高于80%的成分，得到初步结果，并用计算所得的RI 值与标准值作对比，来确定各色谱峰对应的化学成分，得到的结果用峰面积/105表示。

2 结果与分析

2.1 基于核磁共振氢谱（1H NMR）分析发酵豆腐乳清代谢产物

发酵豆腐乳清的一维核磁氢谱如图1a～1f 所示。图1a～1f 分别代表未发酵豆腐乳清、M1+ST3组发酵、M2+ST3 组发酵、M4+ST3 组发酵、C1+ST3发酵、L6+ST3 发酵的豆腐乳清的核磁图谱。对发酵豆腐乳清的代谢物进行谱峰归属，根据Chenomx NMR 数据库以及查阅相关资料，共指认出25 种代谢物质，包括4 种多羟基化合物、12 种氨基酸、7 种有机酸以及2 种其它类物质。指认代谢物的核磁位移和峰多重性如表1所示。从图1a～1f 可以看出，豆腐乳清发酵前后的物质种类差异不大，均指认出有4 种多羟基化合物：葡萄糖、果糖、蔗糖和阿拉伯糖醇。此外，在糖类物质出峰区域（δH3.10-δH5.2）产生了信号重叠，难以对这些糖类进行鉴定，但从发酵前后的谱图对比可以看出，发酵后的糖类物质出峰区域面积较发酵前有所减少，这表明乳酸菌在发酵过程中都能大量的利用糖类物质。此外，还指认出了12 种氨基酸，分别是亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸；指认了7 种有机酸，分别是丁酸、丙酸、乳酸、醋酸、丙酮酸、琥珀酸和柠檬酸。此外，还指认了4-氨基丁酸和胆碱。

图1 发酵豆腐乳清的核磁图谱Fig.1 NMR spectrum of fermented tofu whey

表1 发酵豆腐乳清代谢物的核磁数据Table 1 NMR data for metabolites of fermented tofu whey samples

（续表1）

图2a～2d 为豆腐乳清发酵前、后化学成分的含量变化。从图2a 中糖类物质的变化可以看出，5个发酵组经过发酵后蔗糖含量均减少。值得注意的是，5 个发酵组阿拉伯糖醇的含量较发酵前均有所增加，含量最高的是L6+ST3 组，C1+ST3 组次之。此外，L6+ST3 组和C1+ST3 组发酵后果糖含量升高，表明这2 组发酵剂对果糖的利用率不高。从图2b 中可以发现，发酵后生成了大量的乳酸和乙酸，其中L6+ST3 组乳酸和乙酸的比例接近1∶1。从图2c 可以看出，发酵后琥珀酸显著增加，其中M4+ST3 组增加了4.7 倍；但5 个发酵组柠檬酸的含量均明显减少，说明柠檬酸可被这些乳酸菌代谢利用；GABA 与胆碱含量在发酵后也有一定增加，但幅度不大。从图2d 则可以看到，发酵前后苏氨酸的含量最高，其次是甘氨酸和谷氨酸，且这3种氨基酸含量经L6+ST3 组发酵后都有所增加。

图2 豆腐乳清发酵前后代谢含量变化Fig.2 Changes of metabolic content of tofu whey during the fermentation

从上述代谢物含量的变化可以看到，不同的菌种对糖的利用及产酸的情况不同。其中，L6+ST3组对蔗糖的利用率最低，且对果糖的利用率不高，但会产生较高含量的阿拉伯糖醇。同时，这组发酵剂产生的乳酸较少。由于果糖是最甜的单糖，而阿拉伯糖醇既是一种甜味剂，又是生产木糖醇的中间体[16]，因此可以预见由这组发酵剂制备的发酵豆腐乳清将获得良好的滋味。此外，乳酸菌的柠檬酸盐代谢可以产生挥发性化合物，在发酵乳制品中这些化合物为C4 化合物，如乙偶姻和丁二醇是许多发酵乳制品的典型香气化合物[17]。

从上述代谢物含量的变化还可以看到，不同菌种发酵后产生的生理活性物质乙酸、丙酸、丁酸，以及4-氨基丁酸（GABA）和胆碱有一定的差异，但差异不显著。乙酸、丙酸和丁酸是肠道中主要的短链脂肪酸（SCFAs）[18]，它们既能为大肠细胞提供大量能量，参与机体能量代谢，又能调控营养物质的吸收和激素的产生[19]，并对糖尿病、肥胖症、结肠炎等慢性疾病有一定的改善作用[20-23]。GABA 在一定程度上能够缓解焦虑、紧张等情绪，同时还可预防慢性肾脏疾病，帮助预防糖尿病，以及改善某些神经系统疾病[24-26]。胆碱是人体重要的营养物质，缺乏可能会导致肝损伤等疾病[27]。2018年，Nature 的报道表明琥珀酸能够刺激小鼠脂肪细胞产热，来抵抗饮食诱导的肥胖和血糖问题[28]。而本文的研究结果显示，发酵乳杆菌M4 可能拥有较强的产生琥珀酸的能力，值得进一步研究。

2.2 基于GC-MS 分析发酵豆腐乳清的挥发性风味成分

发酵豆腐乳清的总离子流谱如图3所示，挥发性成分及其丰度如表2所示。共检测到95 种挥发性物质，包括31 种醇类、14 种醛类、21 种酮类、10 种酯类、9 种酸类、4 种酚类以及6 种其它类物质。从图谱可以看出，发酵后豆腐乳清的挥发性成分有了较大的变化。其中，观察到M4+ST3 组的峰面积较小，这可能是因为发酵乳杆菌M4 进行异型乳酸发酵[29]，所产生的大量的二氧化碳气体带走了大部分的挥发性物质。从表2可以看到以下变化，①发酵后醛类物质在每一个发酵组中的丰度和种类都明显减少，而豆腥味往往与正己醛等醛类物质含量相关[30]。②经C1+ST3 发酵后，醇类物质特别是乙醇丰度有明显增加；此外，虽然酯类物质总的丰度有所减少，但增加了乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸异丙酯等特征性酯类香气成分。③经L6+ST3 发酵后，2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮等酮类物质显著增加，这些成分都具有令人愉悦的果香味[31]。④经M1+ST3 发酵后，乙偶姻丰度显著增加，并生成了2，3-丁二酮，与Zheng 等[8]的报道一致。

图3 发酵豆腐乳清挥发性成分的总离子流图Fig.3 Total ion chromatogram of volatile components in fermented tofu whey

表2 发酵豆腐乳清的挥发性香气成分Table 2 Volatile components of fermented tofu whey

（续表2）

（续表2）

对表2中95 种挥发性物质进行主成分分析，结果如图4所示。第1 主成分（PC1）和第2 主成分（PC2）可以解释59.7%的原变量信息，从图4a 可以看出，醛类物质集中在第一象限，酮类和酯类物质较集中于第二象限，醇类和酸类物质集中在第一、二象限，同时与图4b 对应，未发酵豆腐乳清位于第一象限，这说明未发酵豆腐乳清主要成分是醛类物质，且发酵后的豆腐乳清集中在第二、三象限，均远离发酵前的豆腐乳清，说明发酵前后的主成分有明显的变化，其中，C1+ST3 组与L6+ST3组集中在第二象限，均含有较多的风味物质 （酯类、酮类），这与前面分析的结果一致。

图4 发酵豆腐乳清挥发性成分的主成分分析图Fig.4 Principal component analysis of the volatile components of fermented tofu whey

综合以上核磁共振氢谱分析和GC-MS 分析，乳酸菌经过乳酸代谢，利用了蔗糖并生成了大量的乳酸和乙酸，同时经过C4 代谢，利用了柠檬酸盐，生成了乙偶姻、丁二酮等具有奶香味的物质。有的乳酸菌则通过新鲜豆腐乳清含有的苹果酸和富马酸[32]生成琥珀酸[17]。同时，乳酸菌在发酵过程中利用了豆腐乳清的醛类物质，增加了醇类和各种有机酸如丙酸、丁酸等，从而丰富了豆腐乳清的风味。这可能是由于豆腐乳清中的醛类物质被醇脱氢酶还原成醇，以及被醛脱氢酶氧化成羧酸[33]。羧酸不仅是香气成分，还是形成甲基酮、醇、内酯和酯的前体[34]。此外，发酵过程产生了多种具有特征香气的酮类和酯类物质，明显改善了豆腐乳清的风味，这可能是由不饱和脂肪酸的自氧化反应生成的[35]。发酵后增加了GABA 含量，原因可能是乳酸菌经过谷氨酸脱羧酶可以把谷氨酸转化为GABA[35]。

3 结论

豆腐乳清的营养成分丰富，通过应用从自然酸化的豆腐乳清中分离筛选所得的菌种来发酵豆腐乳清，能够保证菌种对环境的适应性，使其生长良好。豆腐乳清经过乳酸菌发酵后短链脂肪酸和GABA、胆碱等功能性成分有所增加，不同的菌种发酵具有不同的风味特征。其中，C1+ST3 组和L6+ST3 组发酵剂，在增加豆腐乳清的营养成分和功能性成分，以及改善豆腐乳清风味方面表现最优，可以作为发酵豆腐乳清的发酵剂，为发酵豆腐乳清饮料的开发应用奠定基础。