王莉，陈尚周，雷淑英，周发琼

（恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北 恩施 445000）

人皮肤鳞状细胞癌（sSCC）和其他非黑色素瘤皮肤肿瘤是导致肿瘤相关死亡的原因之一[1]。流行病学调查表明，全世界20%以上的人群在一生中都有可能患皮肤肿瘤[2]。此外，在过去10年时间里sSCC发病率呈逐渐上升的趋势，其治疗主要依赖于手术、放疗及化疗联合干预，而晚期或转移性皮肤癌预后并不理想[3-5]。分子靶向干预是治疗sSCC较好的选择，这有助于发现新的肿瘤标志物用于诊断和治疗[6]。

跨膜受体蛋白NOTCH1通路是一种重要的细胞内信号转导形式，其关键作用是决定细胞类型和分化[7]；在角质形成细胞中，其诱导分化并抑制肿瘤的发展[8]。NOTCH1在角质形成细胞中的缺失足以增加对皮肤癌形成的易感性[9-10]，并且随着上皮内和侵袭性鳞状细胞癌（SCC）的发展，其真皮内功能的丧失导致皮肤癌变[11]。NOTCH1下游信号CYFIP1是一种新的上皮癌侵袭抑制因子，已有学者提出在结肠癌、乳腺癌和肺癌组织中CYFIP1基因通常缺失[12]。因此，本研究旨在探讨NOTCH1基因对sSCC细胞增殖和凋亡影响的相关作用机制。

1 材料及方法

1.1 细胞培养 非典型角质形成细胞系（HaCaT）、sSCC细胞系（SCL-1和A431）购自武汉巴菲尔生物有限公司。HaCaT、SCL-1和A431细胞均采用含10%胎牛血清（Gibco公司，美国）的DMEM培养基（ScienCell Research Laboratories公司，美国），在37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2 细胞质粒转染 阴性对照质粒（NC）和NOTCH1 siRNA质粒由武汉巴菲尔生物有限公司合成（武汉，中国）按照说明书转染至SCL-1和A431细胞。将NOTCH1 cDNA嵌入pcDNA3.1载体（EurofinsGenomics公司，德国）构建pcDNA/NOTCH1表达载体，空载体（Empty vector）作为对照，并采用Lipofectamine 2000试剂将pcDNA/NOTCH1载体和空载体转染至SCL-1和A431细胞，操作步骤严格按照说明书进行。

1.3 实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（qRT-PCR）实验 SCL-1和A431细胞中总的RNA由Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）提取，并采用QuantiTect逆转录试剂盒（Qiagen公司，德国）合成cDNA。qRTPCR实验操作的终反应体积为10 μL，包含5 μL的SsoFastTM EvaGreen Supermix试剂（Applied Biosystems公司，美国）、1 μL 引物、1 μL 的 cDNA 模板和3 μL 的 ddH2O。引物序列如下：NOTCH1，F：5’-CGTGCAGAGTGAGACCGTGGA-3’，R：5’-TGCGGTCTGTCTGGTTGTGCA-3’；Cyclin D1，F：5’-GAGTAGTGCGAAGCATAGGTCT-3’，R：5’-CTAGCAGAGTAGTCGAGCGC-3’；Bcl-2，F：5’-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3’，R：5’-TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3’；MMP-2，F：5’-TGATCTTGACCAGAATACCATCGA-3’，R：5’-GGCTTGCGAGGGAAGAAGTT-3’。采用 7500 RT-PCR system（Applied Biosystems公司，美国）进行PCR扩增，循环条件如下：50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 3 s进行 40个循环，60 ℃ 30 s。实验重复 3 次，并采用 2-ΔΔCT方法分析mRNA相对表达水平。

1.4 Western blot分析 收集细胞，每组加入200 μL的裂解液，置于冰上充分裂解30 min，收集细胞裂解液，4℃条件下离心12 000 r/min离心半径为15 cm，离心12 min，收集上清。二辛喹酸（BCA）蛋白定量试剂盒检测了上清中总蛋白浓度，每孔上样40 μg进行电泳分离，恒压70 V，电泳3 h。然后在恒流275 mA条件下电转70 min，5%脱脂牛奶封闭1 h后，将目的条带放入对应的一抗溶液（稀释比1∶1 000）中，4 ℃摇床孵育过夜。Tris-HCl缓冲盐溶液+吐温20洗膜缓冲液（TBST）洗膜3次，10 min/次，再把条带放入盛二抗（稀释比1∶3 000）的平皿中室温孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。加入4 mL的ECL显影液显色3 min，凝胶成像系统曝光。

1.5 细胞增殖实验 将各对数期细胞系接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养至50%，转染质粒24 h后，弃去旧培养液，每孔加入100 μL含10 μL的CCK8试剂的DMEM培养液，放入培养箱中继续孵育1.5 h，在酶标仪450 nm波长处检测细胞吸光度OD值，并计算细胞相对活力。计算公式如下：细胞相对活力（%）=OD实验组/OD对照组×100%。

1.6 流式细胞术检测 将各对数期细胞系接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养至50%，转染质粒24 h后，弃去旧培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2次，采用2.0 mg/mL的PI染液和RNaseⅠ染色30 min，流式细胞仪立即检测细胞周期分布情况。另外，收集细胞，PBS重悬后，分别加入Annexin-V FITC和PI处理细胞（按照试剂盒操作说明书进行），最后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，组间两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 sSCC细胞中NOTCH1表达下调 SCL-1和A431细胞中NOTCH1蛋白和mRNA表达水平相比于HaCaT细胞明显降低，差异比较均有统计学意义（P＜0.05）。由此提示，NOTCH1在sSCC细胞中起着抗肿瘤的作用。见图1。

图1 sSCC细胞癌细胞系中NOTCH1表达下调

2.2 NOTCH1过表达抑制sSCC细胞增殖 将pcDNA3.1/NOTCH1质粒转染至SCL-1和A431细胞，NOTCH1蛋白和mRNA表达水平提示NOTCH1过表达组NOTCH1细胞活力相比于对照组明显降低，而细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 2。

图2 NOTCH1过表达诱导sSCC细胞癌细胞凋亡

2.3 NOTCH1沉默诱导sSCC细胞增殖 实验将NOTCH1 siRNA质粒转染至SCL-1和A431细胞，提示NOTCH1沉默组（NOTCH siRNA）细胞活力相比于对照组（NC siRNA）明显增高，而细胞凋亡率显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 NOTCH1沉默诱导sSCC细胞癌细胞增殖

2.4 NOTCH1调节下游CYFIP1信号转导NOTCH1过表达和沉默对CYFIP1蛋白表达水平的影响 研究发现NOTCH1过表达能明显诱导CYFIP1蛋白表达（P＜0.05），而 NOTCH1沉默则显著抑制 CYFIP1蛋白表达（P＜0.05），见图 4。

图4 NOTCH1诱导CYFIP1信号转导

2.5 NOTCH1调节CYFIP1靶基因表达 NOTCH1过表达能明显降低特异性周期蛋白（Cyclin）D1、Bcl-2和MMP-2 mRNA表达，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。NOTCH1沉默能明显增高cyclin D1、Bcl-2和MMP-2 mRNA表达，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图5 NOTCH1调节cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白表达

3 讨论

近年来，NOTCH1信号在肿瘤发生中的作用得到了充分的证实。然而，对于NOTCH1在sSCC中的作用机制研究较少。实验发现NOTCH1在sSCC细胞的表达水平下调，提示可能抑制肿瘤细胞增殖的作用[13]。研究还发现NOTCH1表达上调可通过激活下游靶标CYFIP1信号，进行抑制SCL-1和A431细胞增殖、诱导其凋亡。这些结果表明，NOTCH1与单纯性sSCC的发生密切相关。CYFIP1可诱导细胞Cyclin D1、细胞淋巴瘤蛋白（Bcl）-2及金属基质蛋白酶（MMP）-2等原癌基因的表达，从而改变肿瘤细胞的增殖、周期、凋亡和侵袭能力[14-15]。NOTCH1被认为是CYFIP1转导的正调节子，NOTCH1可与CYFIP1相互作用，进而促使后者表达[12]。本研究发现NOTCH1过表达能明显降低cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白表达，进而抑制SCL-1和A431细胞增殖活力。

NOTCH1信号转导在角质形成细胞中的促分化和抑制肿瘤的功能已经得到证实。NOTCH1激活参与角质形成细胞的细胞周期调控，可通过调节p63、干扰素调节因子（IRF）家族成员及基底整合素的表达直接诱导该细胞分化[16]。本研究还表明NOTCH1信号参与调节sSCC细胞增殖能力通过CYFIP1。迄今为止，在结肠癌、肺癌和乳腺癌模型中，已证明CYFIP1能抑制肿瘤细胞侵袭；相比于正常组织，上述3类特殊肿瘤中CYFIP1表达水平明显降低[17]。本研究结果显示，过表达NOTCH1的SCL-1和A431细胞系中CYFIP1表达水平也随之增高，而沉默NOTCH1的sSCC细胞系中CYFIP1表达水平则明显降低，说明NOTCH1是CYFIP1的正向调节子。

据报道，NOTCH1可抑制多发性肿瘤的生长[18-19]。NOTCH1低表达或沉默可促进上皮-间充质转化（EMT），进一步导致肿瘤细胞侵袭性和耐药性升高[20]。此外，miR-3178通过靶向作用NOTCH1抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和转移[21]。因此，NOTCH1与肿瘤的发生和发展密切相关，可作为肿瘤诊断和预后的一个有潜在价值的指标。NOTCH1基因突变与肿瘤细胞凋亡过程密切相关[22]。本文发现NOTCH1在sSCC细胞中表达显著降低，NOTCH1上调可抑制SCL-1和A431细胞的增殖、诱导其凋亡，NOTCH1下调则发挥相反的作用。上述研究结果也提示，NOTCH1在sSCC中起着抗肿瘤的作用。

总之，NOTCH1对sSCC有抑制肿瘤的作用。研究表明NOTCH1在sSCC细胞中表达下调，NOTCH1过表达抑制与CYFIP1通路激活相关的细胞增殖。本研究为进一步认识肿瘤的分子发病机制提供了新视角，并表明调控抗肿瘤基因NOTCH1表达可能是治疗肿瘤的新策略。