杨卓燃，李 龙，李超逸，吴 琼，王 芳，王文明，杜一平*

（1.华东理工大学 化学与分子工程学院，上海 200237；2.河南省科学院化学研究所，河南 郑州 450002）

黄曲霉毒素（AFT）是黄曲霉和寄生曲霉等菌株产生的双呋喃环类毒素，其衍生物约20 种，分别命名为B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、毒醇等。其中以黄曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最大，致癌性最强［1］。AFB1 的半数致死量（LD50）为0.249 mg/kg，其毒性是氰化钾的10 倍，砷的68 倍，可引起急性中毒和死亡［2－3］。国家标准GB 2761－2017规定了AFB1在各种食物中的限定含量，其中在玉米粉制品中的含量不得超过20µg/kg［4］。目前黄曲霉毒素的主要检测方法包括薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱－质谱联用法和酶联免疫法（ELISA）［5-10］等。薄层色谱法快速便捷，但灵敏度较低［11］，高效液相色谱法和液相色谱－质谱联用法的灵敏度和准确度均能满足国标要求［12］，但需要使用大型仪器，且样品前处理较复杂，检测周期较长，不适合大量样品的快速检测。ELISA法是食品样品中黄曲霉毒素的常规快检方法，该方法较灵敏，样品前处理较简单［13］，但复杂样品的基质效应会影响检测的可靠性，造成结果重复性较差，且易产生假阳性［14］。黄曲霉毒素具有较强的荧光信号，有文献报道汞离子（Hg2+）对黄曲霉毒素分子具有荧光增强效应［15］。本文采用自行构建的LED 灯激发的小型荧光光谱检测装置，基于Hg2+对黄曲霉毒素分子的荧光增强效应建立了AFB1的荧光光谱检测方法。该方法仪器小巧廉价、操作简便、灵敏度高，适用于食品、饲料等样品中AFB1含量的快速检测和现场分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LED 光源（370 nm，5 V，上海闻奕光电科技有限公司）；光纤光谱仪（波长190～800 nm，OEM 机，德国Insion 公司）；PHS－25数字型精密酸度计（梅特勒－托利多国际贸易（上海）有限公司）；超纯水净化系统（≥18.2 MΩ·cm，美国默克集团）；Lumina荧光分光光度计（赛默飞世尔（上海）科技有限公司）。

AFB1（98%，北京百灵威科技有限公司）；硝酸汞（分析纯，贵州铜仁化学试剂厂）；甲醇、乙腈、氯化钠、氯化锌（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；硝酸、氯化钾、氯化钙（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；氢氧化钠（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氯化锰（分析纯，阿达玛斯试剂有限公司）；氯化铝（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；K－49 型玻璃纤维滤膜（德州市科佳环境监测用品厂）；AFB1免疫亲和柱（1 mL，深圳逗点生物技术有限公司）。

AFB1 储备液（10 mg/L）：AFB1 标准品使用甲醇配制，-18 ℃冷藏保存，可储存6 个月；使用时用甲醇稀释，于4 ℃冰箱冷藏，一周内使用。

1.2 LED激发荧光光谱检测装置

目前以LED 灯作为光源的小型光谱仪［16－17］与小型光纤光谱仪［18］均已有广泛报道，但LED 灯激发荧光——直接检测荧光光谱用于黄曲霉毒素检测方面的工作尚未见报道。在课题组前期工作［19－20］基础上，本文构建了LED激发荧光光谱检测装置，如图1 所示。采用中心波长370 nm 的LED 灯作为光源，对比色皿内的样品溶液进行荧光激发，发射光通过光纤导入光谱仪中，使检测器产生荧光信号，由电脑软件采集样品的荧光发射光谱。

图1 荧光检测装置示意图Fig.1 The schematic of the fluorescence device

1.3 实验方法

1.3.1 玉米粉样品的前处理称取2 g玉米粉样品，加入25 mL甲醇－水溶液（体积比4∶1）作为提取液，同时加入2.0 g NaCl粉末破乳，磁力搅拌提取30 min，随后过滤，收集全部滤液于25 mL容量瓶定容；取10 mL滤液，加入20 mL水后以玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清；取15 mL澄清滤液，以黄曲霉毒素B1专用免疫亲和柱进行处理，甲醇洗脱，收集洗脱液于10 mL容量瓶定容，备用。提取液于4 ℃冰箱冷藏，可放置3 d。

1.3.2 黄曲霉毒素B1的荧光光谱测量配制一系列浓度的AFB1溶液，分别取2 mL不同浓度的AFB1溶液与0.5 mL 0.001 mol/L 的硝酸汞溶液在离心管中混匀，随后转移至比色皿中，将比色皿放入检测池后打开LED灯，立即测定体系的荧光发射光谱，以443.2 nm处的发射光强度建立标准曲线。

取“1.3.1”中处理好的玉米粉样品溶液2 mL 于离心管中，加入0.5 mL 0.001 mol/L 的硝酸汞溶液，混匀后立即测定其荧光发射光谱，基于443.2 nm 处的发射强度，使用标准曲线法对玉米粉中的AFB1浓度进行定量。

2 结果与讨论

2.1 激发波长与发射波长的选择

使用Lumina 荧光分光光度计测定AFB1－Hg2+体系的激发光谱和发射光谱，发现367 nm 处激发光谱的强度最高，故选择370 nm 的LED 灯作为激发光源。在370 nm的LED 灯激发下，AFB1－Hg2+的最大发射波长为443.2 nm，故选择该波长为AFB1的分析波长。

2.2 汞离子对AFB1的荧光增强效应

取2 mL 1 mg/L 的AFB1 溶液两份，一份加入0.5 mL 0.001 mol/L的硝酸汞溶液，另一份加入0.5 mL水，测定荧光发射光谱，结果如图2 所示。从图中可见，加入Hg2+后，AFB1 的荧光发射峰峰位基本不变，荧光强度增强约7 倍。有文献报道称［21］，Hg 作为S0金属极易形成AFB1－Hg 八面体配合物，而这类配合物通常会发生配体（AFB1）到金属离子（Hg2+）的电荷跃迁(LMCT 跃迁)，形成2·L 型或者L－L 型或者L－M2+－L 型配体，使反应体系中的刚性结构得以加强同时共轭体系增加，导致发出的荧光量子数增多，进而荧光发射光谱大大增强。

图2 Hg2+对AFB1的荧光增强效应Fig.2 Fluorescence enhancement effect of introducing Hg2+to AFB1 solution

2.3 自搭建的光谱仪性能验证

取2 mL 0.1 mg/L 的AFB1 溶液两份，加入0.5 mL 0.001 mol/L的硝酸汞溶液，分别使用Lumina荧光分光光度计与自搭建的小型光谱检测设备检测其荧光发射光谱，发现两种仪器的光谱形状和发射波长相近，说明所搭建的光谱检测设备可靠。由于激发光谱LED 灯的单色性和光强不如商业仪器，因此光谱噪声相对较高，导致信噪比较低。但以下研究显示其性能满足AFB1 的定量分析要求。

2.4 衍生化条件的优化

2.4.1 pH值对反应体系的影响用稀硝酸和氢氧化钠溶液调节，获得不同pH 值的样品溶液，探索了pH 值对体系荧光强度的影响，结果如图3 所示。从图可知，在pH 3.0～8.0 范围内，体系的荧光强度较为稳定；当pH > 8.0 时，汞的水解作用严重影响荧光信号，而pH<3.0时，荧光强度也呈现减弱的趋势，故测定时体系pH 值控制在3.0～8.0 范围。

图3 pH值对体系荧光强度的影响Fig.3 The influence of pH value on the fluorescence intensity of the system

2.4.2 Hg2+用量对反应体系的影响由于AFB1 分子与Hg2+可结合的位点较多，Hg2+需过量加入。衍生化物的荧光强度随Hg2+用量的增加而增强，在Hg2+与AFB1的浓度比大于80∶1时，荧光强度较高，且变化不大。考虑到荧光强度的稳定性，后续实验选择Hg2+与AFB1的浓度比为200∶1。

2.4.3 甲醇体积分数对反应体系的影响溶剂体系可对荧光发射强度产生明显影响，本研究的溶剂体系中，随着甲醇体积分数的增大，荧光发射强度呈增加趋势，当甲醇体积分数>66.7%时，体系的荧光发射强度基本趋于稳定，且维持在较高的水平。因此后续实验选择体系中甲醇体积分数为80%。

2.4.4 反应时间对反应体系的影响探究了反应时间对实验结果的影响。实验过程中发现，AFB1与Hg2+的反应十分迅速，加入Hg2+即刻就能产生稳定的荧光信号，且反应在2 h 内的荧光强度基本不变。故本实验选择在加入Hg2+后立即测定荧光强度。

2.5 干扰实验

选择玉米粉中可能存在的K+、Na+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Al3+［22－23］进行干扰实验，在反应体系中加入与汞离子浓度相当的上述金属离子，荧光强度的测定结果如图4所示。从图中可以看出，K+、Na+、Ca2+对原体系基本没有干扰，而Zn2+、Mn2+、Al3+则对体系的荧光强度有较明显的干扰。对这3 种离子在实验条件下进行了容忍度实验，结果显示，Zn2+、Mn2+、Al3+在体系中允许存在的最大浓度依次为1.94、1.38、2.42 mmol/L。而通常情况下，玉米粉中不会含有如此高浓度的这3 种离子，因此本研究不会产生金属离子的干扰，即使有也可通过调节pH 值的方法去除。文献［15］还研究了Cl－、醋酸根、柠檬酸根、H2PO4－对AFB1－Hg2+体系荧光信号的影响，发现前3 种离子对体系基本无干扰，而H2PO4－对体系具有增敏作用。因此实际测定中要注意排除H2PO4－的影响。

图4 金属离子对体系荧光强度的干扰Fig.4 Interference of metal ions on the fluorescence intensity of the system

2.6 标准曲线及检出限

按“1.3.2”方法绘制标准曲线。结果表明，AFB1 质量浓度（x）在3～90 µg/L 范围内与荧光强度（y）具有良好的线性关系：y=5.76x+11.9，相关系数r2=0.996。方法的检出限（LOD=3S/K，S为5次空白样品测量的标准偏差，K为标准曲线的斜率）为0.913µg/L。

2.7 玉米粉样品中AFB1的测定

从不同场所购置两种玉米粉样品，利用所建立方法对其中的AFB1 含量进行检测，未检出AFB1，以加标回收率评价方法的准确度，结果如表1 所示。数据显示，两份玉米样品在低、中、高3 个水平下的加标回收率为84.1%～107%，相对标准偏差（RSD）为1.1%～7.1%。方法准确度和精密度较理想，满足欧盟标准和国家标准的测定要求［24－25］。

表1 玉米粉样品中AFB1的检测结果Table 1 Detect results of AFB1 in cornflour

3 结 论

本研究使用LED 激发的小型荧光光谱检测装置，建立了一种基于汞离子荧光增强效应的AFB1 含量的快速检测方法。该方法使用小巧廉价的光谱设备，样品前处理步骤少，检测时间短，获得了较高的检测灵敏度和准确度，具有一定的抗干扰能力，光谱检测结果与商用光谱仪结果相近。同时，该小型光谱仪体积小，具有便携性，未来有望用于食品和饲料样品的现场快速分析检测。此外，本方法作为一种检测样品中低含量分析物的新方法，也非常适用于农业和环境领域中有机污染物的快速检测。