王林燕，王 博，裴艳玲，盛振华，陈森淼，关 旸*

（1.浙江中医药大学 中医药科学院，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学 生命科学学院，浙江 杭州 310053；3.河北鑫民和质检技术服务有限公司，河北 保定 071200）

防风为伞形科植物防风（Saposhnikovia divaricate（Turcz.）Schisck）未抽花茎植株的干燥根，味辛、微甘，性温，具有解表祛风、止痉、胜湿之功效［1］。防风药用历史悠久，在《神农本草经》中被列为上品［2］，主治外感风寒、周身疼痛、头痛目眩、风寒湿痹、骨节疼痛等证，为常用中药材［3］。防风化学成分复杂，主要含色原酮类、香豆素类、多糖和挥发油等［4］。其中挥发油具有抗炎镇痛的作用，是防风的主要有效成分之一［5］。

气相色谱－质谱联用（GC－MS）是分析挥发油种类和含量的主要技术手段［6－10］。GC－Q/TOF MS 相比常规的GC－MS具有更高的准确度和分辨率，定性能力也有所提高［11］，但传统气质联用仪使用70 eV的电子电离源（EI），基本只能得到碎片离子信息，对未知物的分析也多局限于NIST 谱库比对［12］和PCDL 库筛查［13］，如何准确鉴定NIST 谱库未收录的化合物是需要关注的问题。未知物结构鉴定首先需确定化合物的相对分子质量，因此需要“软电离源”，获得分子离子峰。目前常用的方法是用化学电离（CI）源代替EI 源［14］，但离子源之间的切换费时耗力，仪器参数需进行不断调整。本文将采取低能量（Lower energy）电子电离源模式，在不切换离子源的情况下实现“软电离”，获得化合物的分子离子峰；同时使用MS/MS 采集方式，分析分子离子峰的二级碎片，以更好地探索未知化学样品［15］，得到全面完整的结构信息，弥补GC－MS在结构鉴定中的局限和不足。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与样品

Agilent 7250 GC－Q/TOF MS（安捷伦科技公司，美国），移液器、高速离心机（Eppendorf 公司，德国）。乙酸乙酯（HPLC级，Scharlau）。防风饮片（浙江中医药大学中药饮片厂，批号：200901）。

1.2 防风挥发油提取及供试品溶液制备

取防风粉末（40 目）约300 g，置于5 L 的圆底烧瓶中，加蒸馏水2 400 mL 浸泡12 h，按照中国药典2020 年版四部［16］通则挥发油测定法甲法蒸馏得到挥发油。以乙酸乙酯溶解，12 000 r/min 离心15 min，取上清液装入进样瓶。

1.3 色谱－质谱条件

色谱条件：DB－5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25µm，美国安捷伦公司）。程序升温过程：起始温度为55 ℃，以6 ℃/min 升温至250 ℃，维持5 min。载气：氦气，纯度99.999%，流速1.0 mL/min，进样口温度：250 ℃，进样量：1µL，分流比：20∶1。

质谱条件：Standard 模式：EI 源电压：70 eV；离子源温度：200 ℃；GC－MS 接口温度：250 ℃；数据扫描方式：TOF－Scan 全扫描，一级质谱质量扫描范围m/z30～500，采集速率5 spectrum/s；溶剂延迟：3.5 min。

Lower energy 模式：EI 源电压分别为10、12、15 eV；离子源温度：200 ℃；GC－MS 接口温度：250 ℃；数据扫描方式：TOF－Scan全扫描，一级质谱质量扫描范围m/z30～500，采集速率5 spectrum/s；溶剂延迟：3.5 min。

MS/MS模式：EI源电压：70 eV；离子源温度：200 ℃；GC－MS接口温度：250 ℃；前驱离子分别为270.255 9、228.208 9、152.121 2、218.167 6、220.182 3和224.182 4，二级质谱质量扫描范围m/z30～300，采集速率5 spectrum/s；碰撞能量（CE）：20 V；溶剂延迟：3.5 min。

1.4 数据分析

一级质谱数据处理由Unknown Analysis 和MassHunter Qualitative Analysis 软件完成；二级质谱数据通过MassHunter Qualitative Analysis 和Molecular Strcture Correlator（MSC）软件分析。通过NIST 14 和Chemspider谱库检索数据，采用峰面积归一化法计算各化合物的相对含量。

2 结果与讨论

2.1 标准电离源结合NIST 谱库分析鉴定防风挥发油成分

挥发油的总离子流图见图1。将采集的数据导入Unknown Analysis 软件，进行解卷积，减少共流出的干扰。与NIST 14 标准质谱图库进行匹配，结合相关文献和人工图谱解析，共鉴定出防风挥发油成分82 种，其相对含量约占总挥发油含量的80%，分析结果见表1。

图1 防风挥发油总离子流图Fig.1 The total ion current of the volatile oil of Saposhnikovia divaricate

表1 防风挥发油鉴定结果Table 1 The identification of the volatile oil of Saposhnikovia divaricate

（续表1）

（续表1）

由表1 可知，防风挥发油中相对含量较高的化合物分别是人参炔醇、异丁香烯、镰叶芹酮、棕榈酸和亚油酸，其相对含量占挥发油总量的60%。防风挥发油的化合物种类主要有烃类化合物19 种，醛酮类18种，醇类17种，酸类16种，酯类8种，以及其他类化合物。

2.2 低能量电离源结合二级质谱对NIST谱库中鉴定的化合物进行验证

2.2.1 采用低能量电离源模式验证化合物的分子离子峰选择2，4-癸二烯醛（RT=12.816 1）、肉豆蔻酸（RT=22.066 8）和棕榈酸甲酯（RT=24.916 9）3 个分离度较好、分子离子峰较显著的化合物进行验证。在15、12、10 eV 3 种不同的离子源电压下观察准分子离子峰的变化。随着离子源电压的降低，2，4-癸二烯醛、肉豆蔻酸和棕榈酸甲酯的分子离子峰m/z= 152.120 1、m/z= 228.209 6 和m/z=270.257 4的相对丰度均升高。

2.2.2 分子式及结构式的验证以m/z=152.120 1、228.209 6 和270.257 4 作为母离子进行Targeted MS/MS 分析，MS/MS 图谱如图2 所示。3 个化合物计算所得的分子式中分别含C10H16O（2，4-癸二烯醛）、C14H28O2（肉豆蔻酸）和C17H34O2（棕榈酸甲酯），具体鉴定结果如表2所示。将化合物的碎片离子信息导入MSC 软件，利用Chemspider 数据库进行查找比对，鉴定结果中含2，4-癸二烯醛、肉豆蔻酸和棕榈酸甲酯，得分分别为87.8、92.4 和93.4。采用低能量电离源结合二级质谱对NIST 谱库中鉴定的化合物进行验证，两种鉴定方式得到的结果一致，可相互佐证。

表2 分子式鉴定结果Table 2 The results of molecular formula identification

图2 2，4-癸二烯醛、肉豆蔻酸和棕榈酸甲酯的MS/MS图Fig.2 The MS/MS data of 2，4-decadienal，tetradecanoic acid and hexadecanoic acid，methyl ester

2.3 NIST谱库中未检索出的化合物峰的分析鉴定

经筛选，确定RT=19.529 0和RT=23.515 0两个色谱峰为待测未知物并进一步分析。

2.3.1 采用低能量电离源模式确定未知物的分子离子峰在15、12、10 eV 3 种不同的低能量电离源模式以及标准电离源（70 eV）模式下，未知物离子碎片的相对强度变化如图3所示。

图3 未知化合物在不同离子源电压下的TOF－Scan质谱图Fig.3 TOF－Scan mass spectra of unknown compounds at different ion source voltages

随着离子源电压的降低，不同质荷比的质谱峰相对强度发生显著变化。总体趋势为：随着离子源电压降低，碎片的绝对丰度显著下降，但高质荷比碎片的相对丰度逐渐升高，低质荷比碎片的相对丰度逐渐降低。RT = 19.529 0 的质谱图中，m/z= 218.167 5 和m/z= 220.182 0 的质荷比相对较大，且随着离子源电压降低相对丰度显著升高，因此推断两者为该保留时间下化合物的分子离子峰，此色谱峰可能含有两种或两种以上化合物，未完全分离。同理，在RT = 23.515 0 的质谱图中，推断m/z=244.182 2 为该保留时间下化合物的分子离子峰。m/z=244.182 2 化合物在12 eV 和10 eV 离子源电压作用下，分子离子峰已占绝对优势，只在高质荷比位置产生少量碎片，表明此化合物的分子离子峰比较稳定。

2.3.2 未知物的分子式预测综上，选择m/z= 218.167 5、220.182 0 和244.182 2 作为母离子进行Targeted MS/MS 分析计算分子式，分别得到RT = 19.525 0，m/z= 218.167 6 的化合物1（Cpd1）；RT =19.529 0，m/z=220.183 3 的化合物2（Cpd2）；RT=23.515 0，m/z=244.183 2 的化合物3（Cpd3）。具体鉴定结果如表3所示，MS/MS图谱如图4所示。Cpd3的各项得分均较高，提示此化合物的分子式鉴定结果可靠。Cpd2化合物分子式鉴定中，同位素丰度得分较低，可能受Cpd1的干扰；二级碎片的得分也不高，但因二级碎片与结构相关性较大，故二级碎片的匹配度进一步参考MSC匹配结果。Cpd1也导入MSC做进一步分析。

表3 未知物分子式鉴定结果Table 3 The molecular formula identification of unknown compounds

图4 未知化合物MS/MS图Fig.4 The MS/MS data of unknown compounds

2.3.3 未知物的结构推断将3个化合物的碎片离子信息导入MSC软件，利用Chemspider数据库进行查找比对，Cpd1 化合物结构式的鉴定结果得分较低（86.2），不做进一步分析，Cpd2 和Cpd3 的鉴定结果如表4所示。

表4 化合物结构式鉴定结果Table 4 Structural formula identification of compounds

经查询，Chemspider 数据库中检索出的Cpd2 与Cpd3 均未收录在NIST14 库中。Cpd2 化合物的质谱图中，m/z=205.158 6的相对丰度较高，为丢失支链CH3形成的碎片峰；m/z=149.095 8的基峰，为共轭烯烃常见的烯丙基型裂解，共轭链延长，稳定性增强；m/z=110.072 8 为烯烃化合物发生麦氏重排后的碎片，双键位置发生变化。具体裂解方式如图5所示。

图5 （5E，7E，11S）-5，11-二甲基-5，7-十四碳二烯-1-炔-4-醇的裂解途径Fig.5 Fragment pathways of（5E，7E，11S）-5，11-dimethyl-5，7-tridecadien-1-yn-4-ol

Cpd3 化合物质谱图中的m/z=215.143 5 相对丰度较高，此质谱峰为共轭烯炔烃的烯丙基型裂解，所得碎片形成稳定的共轭多烯炔醇，故相对丰度高。其余碎片大多为双键的α-裂解，或由羟基脱水形成更长链的共轭体系。结合文献和碎片裂解规律，推断Cpd3 为（6S，7E，9E）-7，9-十七碳二烯-11，13-炔-6-醇，其裂解方式如图6所示。

图6 （6S，7E，9E）-7，9-十七碳二烯-11，13-炔-6-醇的裂解途径Fig.6 Fragment pathways of（6S，7E，9E）-7，9-heptadecadiene-11，13-diyn-6-ol

3 结 论

本文结合标准电离源/可变能量电离源与二级质谱联用的GC－Q/TOF MS 技术快速鉴定了防风挥发油成分，共鉴定出化学成分84 种。采用GC－Q/TOF MS 的标准电离源（70 eV）与NIST 谱库相结合，可以进行多种化合物的鉴定；对于NIST 谱库中未收录的化合物，可充分利用Lower energy 功能，明确化合物的分子离子峰，同时结合二级质谱分析碎片离子，鉴定其结构。本研究拓展了气质联用技术在未知化合物结构鉴定中的应用，打破了EI离子源“硬电离”的局限，无需切换其它电离源，可方便快捷地获取化合物的分子离子信息，同时兼顾NIST谱库检索，实现了高通量、高覆盖率的成分解析，为中药挥发油甚至各种未知物的全面快速鉴定提供了重要思路和途径。但可变能量电离源和二级质谱联合的GC－Q/TOF MS 适用于分子量较大、分子离子峰丰度相对较高的化合物，对于低能量电离源作用下也无法获得分子离子峰的化合物，较难开展下一步研究。