宋强强，轩慧勇，刘雪连，宋超慧，徐琦琦，秦蕾，夏利宁*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.北京大北农科技集团股份有限公司，北京 100192；3.新疆草食动物新药研究与创制重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052)

沙门菌(Salmonella)是肠道常见的人畜共患病原菌之一，其宿主广泛，可引起人畜多种急性、慢性或隐性感染，沙门菌引发疾病的暴发给养殖业带来巨大经济损失，并严重威胁人类健康[1]。抗菌药物一直是养殖企业治疗沙门菌病的首选药物[2]，在长期不断增长的抗菌药物选择性压力下，沙门菌耐受抗菌药物的种类不断增加，多重耐药基因mcr1-9[3]、tet(X3)和tet(X4)[4]等在动物源沙门菌中不断涌现。王亚楠等[5]研究表明，养殖业是耐药菌产生的重要来源，耐药基因可沿着食物链进行传播。因此，亟待有效进行动物源沙门菌的鉴定和耐药沙门菌的控制。新疆焉耆地区以小中型散养户为主，未形成规范化的用药标准，其不同动物源沙门菌的流行现状和耐药情况不清。针对以上问题，本研究中，从新疆焉耆县的鸡源、羊源、猪源和牛源4 种动物源的粪样中分离沙门菌，对其进行耐药性及相关耐药基因的检测，分析不同动物源沙门菌流行情况及其耐药特征，旨在为该地区养殖业临床的合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品

2019 年10 月，在新疆焉耆地区分别采集羊(200份)、猪(300 份)、牛(100 份)和鸡(300 份)肛拭子样品，共计900 份。

1.1.2 质控菌株及培养基

大肠埃希菌ATCC25922 作为标准质控菌，购于杭州天和微生物试剂有限公司；MH 肉汤、SS 琼脂培养基、沙门显色培养基购自青岛海博生物技术有限公司；1×TE 缓冲液购自上海生工生物有限公司；DNA Maker DL 2000 购自天根生化科技(北京)有限公司；2×TaqPCR Master Mix、琼脂糖、50×TAE和核酸染料均购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离和鉴定

将采集的样品在SS 培养基上划线，37 ℃恒温培养18～24 h 后，SS 培养基上生长出形态为中间黑色周边无色的菌落，初步鉴定为沙门菌。将SS 培养基上初步鉴定的菌落划线于沙门显色培养基，37 ℃恒温培养18～24 h 后，沙门显色培养基上生长出淡紫色单菌落，进一步鉴定为沙门菌。对沙门菌特异性侵袭基因invA[6]进行PCR 鉴定。该基因的PCR产物大小为284 bp，PCR 扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收，送至上海生工生物有限公司进行测序，测序结果用BLAST进行序列比对，同源性大于96%的结果判定该菌株的鉴定结果。

1.2.2 药敏试验

药敏试验按美国临床实验室标准委员会(CLSI)[7]推荐的琼脂稀释法进行。对分离的沙门菌进行11 种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)的测定。标准质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，结果判定参照CLSI 标准，判断结果分别以敏感(S)、中介(I)和耐药(R)共3 种形式表示。

1.2.3 耐药基因检测

选取β-内酰胺类耐药基因blaCMY-2、blaTEM、blaOXA，四环素类耐药基因tetA、tetB，喹诺酮类耐药基因qnrS、oqxA、oqxB、aac(6′)-Ib-cr，氨基糖苷类耐药基因aac(6′)-Ib、aadA2、ant(3")-Ia，酰胺醇类耐药基因floR，多肽类耐药基因mcr-1共6 类14 种耐药基因[8-9]进行检测。对检出aac(6′)-Ib基因的使用BstF5I 酶进行酶切，若存在-cr突变，则aac(6′)-Ib基因将不能被切割，即变异为aac(6′)-Ibcr基因。以上耐药基因引物由上海生工生物有限公司合成。

DNA 模板制备：将纯化后的沙门菌接种于SS培养基上，37 ℃培养12 h 后挑单菌落于1×TE 缓冲液中，放入PCR仪中，设置程序为95 ℃运行10 min，拿出迅速置于冰块中，10 min 后取出，DNA 模板制备完成。PCR 反应体系为20 μL：模板DNA 1 μL、2×TaqMaster Mix 10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、ddH2O 8 μL。取7 μL PCR 扩增产物，经加过核酸染料的1%琼脂糖凝胶电泳后，取胶块于凝胶成像仪进行成像分析，将正确条带的PCR 产物回收纯化，送至上海生工生物有限公司测序，测序结果用BLAST 进行同源性分析。

1.2.4 数据统计分析

耐药结果采用Excel 2019 和SPSS 17.0 进行统计分析，用卡方检验分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 沙门菌的分离和鉴定结果

分离的沙门菌在SS 培养基上为黑色、表面光滑的圆形单菌落(图1)。分离菌在沙门菌显色培养基上为小圆形、淡紫红色、表面湿润的单菌落(图2)。

图1 沙门菌在SS 培养基上的生长状态Fig.1 Growth status of Salmonella on SS medium

图2 沙门菌在显色培养基上的生长状态Fig.2 Growth status of Salmonella on chromogenic medium

PCR 扩增出与阳性菌株片段大小(284 bp)一致的目的片段，且目的条带单一明亮，无杂带(图3)，经测序比对后同源性大于96%，即判定为沙门菌。

图3 部分菌株invA 基因的PCR 检测结果Fig.3 PCR identification results of part of invA gene

经SS 培养基、沙门显色培养基和invA基因鉴定，新疆焉耆地区不同动物源样品共分离出191 株沙门菌(表1)。动物源沙门菌总体分离率为21.2%；牛源沙门菌分离率最高，达62.0%；羊源沙门菌分离率最低，仅为8.5%。

表1 新疆焉耆地区动物源沙门菌的分离率Table 1 Isolation r ates o f Salmonella fr om anim al sour ces in Yanqi, Xinjiang

2.2 动物源沙门菌的耐药性

由表2 可知，不同动物源沙门菌对被检11 种抗菌药物呈现不同的耐药结果，且对主要抗菌药物的耐药种类不同：鸡源菌耐药谱最宽，对11 种被检药物中的8 种药物耐药，对四环素(76.5%)和氟苯尼考(70.6%)的耐药率高于其他动物源的；羊源菌对11种被检药物中的7 种抗菌药物耐药，对氨苄西林耐药率高达88.2%，高于其他动物源；猪源菌对11 种被检药物中的5 种抗菌药物耐药，对氟苯尼考耐药率超过50.0%；牛源菌对11 种被检药物中的4 种抗菌药物耐药，对环丙沙星(66.1%)和氨苄西林(64.5%)的耐药率超过60.0%。除鸡源沙门菌对阿米卡星耐药率为24.7%外，其余动物源沙门菌对阿米卡星无耐药菌株检出，且不同动物源沙门菌对亚胺培南、多粘菌素和磷霉素高度敏感，无耐药菌株检出。

表2 新疆焉耆地区动物源沙门菌耐药结果Table 2 Results of resistance to Salmonella from animal sources in Yanqi, Xinjiang %

2.3 动物源沙门菌多药耐药性及耐药谱型

从表3 可知，不同动物源沙门菌对被检抗菌药物均有多药耐药菌株检出，多药耐药菌株占比高达46.1%，耐受2 种以上抗菌药物的菌株占61.3%。其中，羊源沙门菌多药耐药在0～3、5～7 耐有分布，以1 耐(35.2%)和7 耐(23.5%)为主，占58.7%；猪源沙门菌多药耐药在0～4 耐有分布，以1 耐最高，多药耐药率达40.8%；牛源沙门菌多药耐药在0～4 耐有分布，以0 耐(21.0%)、2 耐(19.3%)、4 耐(38.7%)为主，占79.0%，其中以4 耐最高；鸡源沙门菌多药耐药在0～3、5～7 耐有分布，以1 耐(21.2%)、2耐(15.3%)、3耐(17.6%)和6耐(15.3%)为主，占69.4%。

表3 新疆焉耆地区动物源沙门菌的多药耐药率Table 3 Multidrug resistance rates of Salmonella from animal sources in Yanqi, Xinjiang %

耐药谱型结果显示，不同动物源沙门菌耐药谱型多样化，191 株沙门菌共检出38 种耐药谱型。鸡源沙门菌共有12 种耐药谱型，以2 耐、3 耐和6 耐谱型为主；2 耐谱型中以 TET+FFC 为主，占11.8%(10/85)；6耐谱型中以CIP+AMK+AMP+CEF+TET+FFC 为主，占15.3%(13/85)；5 株7 耐菌株的谱型均为CIP+AMK+GEN+AMP+CEF+TET+FFC。牛源沙门菌共有10 种耐药谱型，以2 耐和4 耐谱型为主；2 耐谱型中以CIP+AMP 为主，占14.5%(9/62)；4 耐谱型中以CIP+AMP+TET+FFC 为主，占38.7%(24/62)。猪源沙门菌有9 种耐药谱型，以TET 为主要普型(22.2%，6/27)。羊源沙门菌有7 种耐药谱型，以耐AMP 为主要谱型(35.3%，6/17)。

2.4 动物源沙门菌的耐药基因

从表4 可知，不同动物源沙门菌中除qnrS和mcr-1基因未检出外，其余被检耐药基因均有检出，且牛源沙门菌对所检耐药基因检出率最高，在35%以上，羊源与猪源沙门菌对以上耐药基因检出率在20%左右，鸡源沙门菌对以上耐药基因检出率不到10%。其中，不同动物源沙门菌中检出的β-内酰胺类基因以blaTEM和blaOXA为主，牛源沙门菌blaTEM基因检出率最高，达79.0%，仅在猪源沙门菌中检出1 株菌携带blaCMY-2基因；不同动物源沙门菌中检出的四环素类耐药基因均以tetB基因为主，仅在猪源沙门菌中检出tetA基因，检出率为22.2%；不同动物源沙门菌中喹诺酮类耐药基因oqxA、oqxB，氨基糖苷类耐药基因aac(6′)-Ib、aadA2、ant(3")-Ia和酰胺醇类耐药基因floR的检出率为9.4%～46.8%。检出的aac(6′)-Ib基因全部存在-cr变异，即存在aac(6′)-Ib-cr基因介导的喹诺酮耐药。

表4 新疆焉耆地区动物源沙门菌耐药基因的检出率Table 4 Detection rates of resistance genes of Salmonella from animal sources in Yanqi, Xinjiang %

3 结论与讨论

本研究中，从不同动物源粪样中分离沙门菌，沙门菌的整体分离率为21.2%，该结果与宋雪等[10]报道的(健康畜禽沙门菌分离率为20.67%)相近。不同动物源沙门菌的分离率相差较大，其中牛源沙门菌分离率最高，达62.0%，远高于王华然等[11]报道的集中饲养牛源沙门菌检出率为21.43%、散养牛源沙门菌检出率为5.05%的结果。本研究中，羊源样本沙门菌分离率仅为8.5%，远低于江萍等[12]报道的结果(51.5%)。本研究从4 种动物源中均分离出了沙门菌，显示出沙门菌普遍存在于养殖业中。此外，不同动物源沙门菌的携带率相差大，与不同养殖场是否暴发过沙门菌病有关。而不同养殖场使用的抗菌药物和消毒剂的种类不同，也是造成沙门菌分离率差异较大的原因之一。

药敏试验结果显示，不同动物源沙门菌均对氨苄西林、四环素和氟苯尼考有较高的耐药性，耐药率均在30%以上。其中鸡源沙门菌对四环素和氟苯尼考耐药率最高，达70.0%以上，该耐药结果与夏宇飞等[13]报道的相近，但高于颜卫等[14]报道的结果。四环素和氟苯尼考作为广谱抗菌药物，对很多感染性疾病的治疗有很好的疗效。养殖场用药调研结果显示，这2 种药物长期、大量地应用于临床，使该地区沙门菌对这2 种抗菌药物具有较高的耐药率。此外，不同动物源沙门菌对被检抗菌药物的耐药种类不同。如羊源沙门菌主要对氨苄西林耐药率较高，牛源沙门菌主要对环丙沙星和氨苄西林耐药率较高，而猪源和鸡源沙门菌则主要对四环素和氟苯尼考耐药率较高。结合用药调研结果发现，不同养殖场所用的主要抗菌药物种类不同；因此，不同动物源沙门菌对被检抗菌药物的耐药种类也不同。但不同动物源的沙门菌对磷霉素和亚胺培南均无耐药菌株，这与部分报道[15-17]的研究结果相符。

本研究中，多药耐药菌株占比高达46.1%，耐药谱分为38 个谱型，耐受2 种以上抗菌药物的菌株占61.3%，最多可同时耐7 种抗菌药物。不同动物源沙门菌显示出多药耐药性和谱型多态性，与牟豪等[18]报道的情况基本一致。可见，对于焉耆地区日趋严重的沙门菌耐药性需持续加强耐药监测。此外，应结合耐药结果，通过规范临床抗菌药物的使用和联合用药，减少多药耐药株的不断增加。

耐药基因检测结果显示，新疆焉耆地区不同动物源沙门菌耐药基因携带率高，且不同动物源沙门菌均以同时携带blaTEM、blaOXA、tetB、oqxA、oqxB、aac(6′)-Ib-cr、aadA2、ant(3")-Ia、floR耐药基因为主。说明以上耐药基因在新疆不同动物源沙门菌中广泛分布，不同动物源沙门菌主要携带的耐药基因略有差异。牛源沙门菌耐药基因携带率略高于其他3 种动物源，猪源和羊源沙门菌耐药基因携带率较为接近，鸡源沙门菌耐药基因的携带率最低。不同地区耐药基因携带率具有较大差异，李军朝[19]对扬州及周边地区不同动物源分离的沙门菌进行6 种沙门菌外排泵基因检测，不同动物源沙门菌外排泵基因阳性率均在90%左右，这说明外排泵基因在沙门菌当中有着广泛的分布；何英[20]对重庆部分地区不同动物源沙门菌ESBL 耐药基因检测结果显示，ESBL 耐药基因阳性率高达89.5%，其中以blaTEM检出率最高，达85.5%，本研究结果与其相近；牟豪[21]对重庆地区不同动物源沙门菌PMQR 基因检测结果显示，76.9%的沙门菌至少携带1 种PMQR基因，检出率最高的是oqxB(57.1%)，PMQR 阳性菌株中常见的基因表型为qnrB+oqxA+oqxB+aac(6′)-Ib-cr和oqxA+oqxB+aac(6′)-Ib-cr，分别占总数的14.3%和11.4%；岂晓鑫[22]对1950—2009 年中国沙门菌耐药基因的检测结果显示，以sul2、blaTEM和tetA这3 种耐药基因检出率较高，分别为76.19%、71.43%和61.90%，耐11 种以上抗菌药物的耐药菌均检出携带有blaOXA、aacC4、aac(6′)-Ib、floR和tetA，推测此基因组合可能是其成为超级耐药克隆的主要原因。以上研究结果可以看出，中国不同地区动物源沙门菌主要以携带aac(6′)-Ib-cr喹诺酮类耐药基因、blaTEM头孢类耐药基因和外排泵耐药基因为主。

本研究中，鸡源沙门菌耐药基因检出率结果与耐药结果没有绝对相关性，部分耐药表型菌株未检测到相应的耐药基因，如药敏结果显示鸡源沙门菌对四环素和氟苯尼考的耐药率在70.0%以上，而tetB和floR基因的检出率仅有9.4%，该耐药结果与李军朝[19]报道的耐药现象(32 株沙门菌分离株对所有受试抗生素均敏感，但外排泵基因阳性率也均在90%以上)不同。可见，沙门菌的耐药与否与耐药基因的存在是否存在必然联系有待进一步研究，可能存在其他未检测的相应耐药基因(tetK、tetM等)或由其他机制介导的耐药。

本研究中，新疆焉耆县不同动物源沙门菌的耐药情况严重，耐药谱型多样化，以牛源沙门菌耐药情况最为严重。不同动物源沙门菌对氨苄西林、四环素和氟苯尼考耐药率高，且耐药基因的携带率最高。在临床治疗沙门菌引起的疾病时，可选用阿米卡星等敏感率较高的抗菌药物，这样才会有更好的治疗效果，以减少抗菌药物的滥用，降低细菌产生耐药性的风险。