刘钰坤，周东波，汪耀富，沈程文，李彦，戴林建*

(1.湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128；2.湖南中烟工业有限责任公司技术中心，湖南 长沙 410007)

烟叶调制是烤烟品质形成的关键环节[1-3]，目前主要采用密集烘烤方式调制[4]。笔者以云烟87 中部叶为原料，借鉴传统红茶加工工艺[5-8]，即萎凋、揉捻、发酵、干燥4 个阶段，通过调控反应条件进行调制，检测烟叶调制过程中产生的代谢物，对不同处理的烟叶样本进行评吸，研究不同工艺参数对调制结果的影响，探讨烟草仿红茶调制工艺的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烤烟品种为云烟87。

1.2 试验设计

试验于2019 年在湖南省浏阳市永安镇进行。取适熟中部(8～9 有效叶位)烟叶。借鉴红茶加工方法，即萎凋→揉捻→发酵→干燥加工烟叶。A1，覆膜萎凋；A2，烤房萎凋。B1，发酵6 h；B2，发酵8 h。C1，68 ℃烘干；C2，85～105 ℃烘干(两段式烘干)。共8 个处理：A1B1C1、A1B1C2、A1B2C1、A1B2C2、A2B1C1、A2B1C2、A2B2C1、A2B2C2，以常规三段式密集烘烤[9]为对照(CK)。

覆膜萎凋：将烟叶平铺于萎凋槽(6CWD-5M)中，摊叶2～3 层，用塑料薄膜覆盖萎凋槽，开机萎凋。烤房萎凋：将烟叶挂杆，放入烤房，促变黄萎凋。揉捻：将萎凋后的烟叶去除主脉，均匀切成小块(10 cm×10 cm)投入揉捻机(6CR-40)中揉捻20 min。发酵：将揉捻后烟叶置入发酵筐，堆叶厚度10 cm，留出气孔，在烟叶上下均匀地铺盖润湿的纱布，放入发酵机(6CHFJ-5B)中或置于干燥阴凉处进行发酵。干燥：烟叶平铺于干燥盘中，提香机(6CHT-6.0)预热，达到指定温度后进行干燥。两段式烘干：先在85 ℃条件下烘干15 min，取出烟叶静置20 min回潮，其间将提香机温度提升至105 ℃，再烘干烟叶。

烤烟样香气化学成分检测(LC-MS 和GC-MS)参照郑庆霞等[10]的方法进行。

邀请湖南中烟有限责任公司技术中心具有烟草行业评吸资质的7 位专家，对仿红茶调制烟叶样品进行评吸，评吸指标包括香气质、香气量、浓度、劲头、刺激性、杂气、余味、燃烧性等。考虑到调制产品与常规烤烟有异，评吸结果只用文字表述记录。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2019 对试验数据进行处理；采用Python、MetaboAnalyst 在线应用进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 仿红茶调制工艺烟叶的评吸结果

仿红茶调制工艺烟叶的评吸结果(表1)表明，仿红茶调制工艺烟叶样品的评吸结果优于对照三段式烤烟样品的；覆膜萎凋(A1)评吸结果优于烤房萎凋(A2)的，85～105 ℃两段式烘干(C2)优于68 ℃恒温烘干(C1)的；对照样品有稍有枯焦气息等负面评价，烤房萎凋(A2)样品除A2B2C1外都出现了有青杂气等负面评价，总体评吸结果与对照样品基本一致；覆膜萎凋(A1)样品都具有干草香、甜度、香气细腻柔和；68 ℃烘干(C1)样品都具有甜香、香气细腻柔和等优点；85～105 ℃两段式烘干(C2)样品都具有干草香、香气细腻、香气浓度中等偏大等优点。

表1 仿红茶调制工艺烟叶样本的评吸结果Table 1 Smoking quality analysis of tobacco leaves imitating black tea modulation process

2.2 仿红茶调制工艺烟叶与常规烤烟化学成分的差异

由仿红茶调制工艺烟叶与常规烤烟化合物含量分布(图1)可看出，试验样本与对照样本中化合物含量存在差异。基于统计分析，将对照样本化合物含量与试验样本化合物含量相差超过三倍标准差的化合物，作为对照样本与试验样本间的差异化合物，共鉴定到2380 种差异化合物，如亚油酸、亚麻酸、油酸、亚油酸甘油、十六酰胺、水仙苷、L-精氨酸、6-羟基氰基、2,3’-联吡啶、金丝桃苷等，占化合物总数的43.26%，其中LC-MS 共检出2303种差异化合物，GC-MS 共检出77 种差异化合物。

图1 仿红茶工艺调制烟叶与常规烤烟化合物含量分布热图Fig.1 Heat m ap of c ompound c ontent dis tribution i n flue-cured to bacco le aves b y im itating b lack te a pr ocess and i n c onventional flue-cured tobacco leaves

2.3 影响仿红茶调制工艺烟叶化合物含量的主要因素

通过仿红茶工艺参数(凋萎方式、发酵温度、发酵时间、烘干条件)与化合物含量的皮尔森相关系数来反映各因素对烟叶样本中化合物含量的影响，相关系数大于0.5 且相关系数显著性小于0.05，则认为该参数与该化合物相关。萎凋方式(A)与2595 种化合物含量相关，占比47%；发酵时间(B)与196种化合物相关；干燥条件(C)与490 种化合物相关。说明与发酵时间和干燥条件相关的化合物数量相对较少，因此，覆膜萎凋和烤房萎凋是影响烟叶样本中化合物含量的主要因素。

根据聚类结构(图2)，将试验处理分为两大类：A1B1C1、A1B1C2、A1B2C1、A1B2C2称为F 类；A2B1C1、A2B1C2、A2B2C1、A2B2C2称为C 类。该分类结果与烟叶样本的前处理方案对应，即F 类样本的萎凋方式为覆膜萎凋，C 类样本的萎凋方式为烤房萎凋。该结果表明烤房萎凋和覆膜萎凋对烟叶样本中的化合物含量有显著影响。

图2 仿红茶调制工艺烟叶样本的主成分分析与聚类分析结果Fig.2 PCA and HCA analysis of tobacco samples prepared imitating black tea modulation process

2.4 仿红茶调制不同工艺烟叶的差异化合物

由图3 可知，利用OPLS-DA 差异检验方法鉴定到2708 种标志性化合物(图3-a)，烤房萎凋样品分布在置信区间左侧，覆膜萎凋样品分布在置信区间右侧，2 类样品区分效果非常明显；利用倍性变化与t检验鉴定到757 种差异化合物(图3-b)；整合2 种差异化合物鉴定方法的结果，共鉴定出关键差异化合物757 种(图3-c)。

图3 不同萎凋方式烘烤烟叶的差异化合物Fig.3 Differential compounds in tobacco samples with different withering methods

针对鉴定到的共同差异化合物(前25 种)进一步进行热图(图4)展示，有7 种差异化合物在烤房萎凋时上调，18 种差异化合物下调，而覆膜萎凋反之。随机选取4 种化合物展示萎凋方式间化合物的相对含量，结果表明烟叶烤房和覆膜萎凋主要影响黄酮、多酚、脂质、生物碱、氨基酸等的含量。

图4 仿红茶调制工艺样本不同萎凋方式的差异化合物(前25)的热图聚类Fig.4 Thermogram clustering of differential compounds(top25) in samples(prepared imitating black tea preparation process) with different withering methods

3 结论与讨论

本研究结果表明，仿红茶调制工艺烟叶与常规烘烤烟叶有2380 种差异化合物，占化合物总量的43.26%，说明仿红茶调制工艺烟叶与常规烘烤2 种调制方法区别较大；比较萎凋方式、发酵时间和干燥方式，萎凋方式对烟叶化合物含量影响最大，有2595 种化合物含量与其有显著相关性，占比47%。这与烟叶烘烤过程中萎凋期作用类似，董志坚等[11]的研究表明，萎凋期的主要作用是使烟叶内部大分子物质充分代谢，形成香气前体物质，使烟叶香气更加醇和。武圣江[12]认为，萎凋期是烟叶调制过程中生理生化变化最为关键的步骤之一，对烟叶品质的形成至关重要。这说明不论是常规烘烤还是仿红茶调制工艺试制，萎凋都是极为重要的调制步骤。合理的萎凋可以调控烟叶内相关酶活性，从而控制烟叶内部大分子物质的降解速度和降解程度，并控制烟叶细胞水平的脂膜破坏时间和程度，保障烟叶酶促反应的正常进行[13]，由此可推断萎凋是烟叶调制过程中主要香气物质的形成时期。从评吸结果来看，烤房萎凋烟叶多具有青杂气，而覆膜萎凋具有干草香等特征香气。综合来看，覆膜萎凋效果好于烤房萎凋的。

发酵时间对烟叶化合物含量影响较小，这可能与试验设置有关。本研究结果也表明，有490种化合物与干燥方式有显著相关性，与萎凋方式相比较少；而从评吸结果来看，2 种干燥方式结果差异较大，两段式烘干有干草香等特征香气，且与传统烤烟评吸具有较大不同，说明干燥方式不仅影响烟叶香气成分物质和常规化学成分，还影响烟叶的香气量、香气质和刺激性等感官评吸质量。