李双祁，刘国峰，王亚惠，赵肃清

(1.广东工业大学生物医药学院，广东 广州 510006；2.湖南菲勒生物技术有限公司，湖南 长沙 410205；3.中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205)

灵芝(Ganoderma lucidum)又称“瑞芝” “仙草”，是一种珍稀食药两用真菌，具有修复受损细胞、促进角质层更新、淡斑、美白、抗衰老、提高免疫力等功效[1]。灵芝含有多糖类、三萜类、氨基酸、多肽类、凝集素、甾醇类、生物碱、酶类、矿物元素等多种活性成分，其中，发挥生物活性的主要成分是灵芝多糖和三萜类化合物[1-6]。在中国灵芝用于中草药护肤品和滋补品已有2000 多年的历史[7]。灵芝在化妆品中的应用形式主要是子实体水提物和醇提物，其主要应用于抗衰老领域，但对其美白、抗炎、抗过敏、防辐射、抗菌、防冻等功效的研究较少[8]。

目前，化妆品中的美白功效成分主要有熊果苷、曲酸、烟酰胺、维生素C 及其衍生物等[9]，但这些原料存在稳定性差、易过敏、生产成本高等问题[10]。随着人们生活水平的不断提高，消费者对日化产品温和性的要求也不断提高，化妆品原料天然化成为了发展趋势[11]。灵芝作为中国的十大“仙草”之一，其美白功效越来越受到关注。有研究[8]报道，以灵芝子实体为培养基，以酵母菌和乳酸菌为发酵菌种，灵芝发酵液对酪氨酸酶活性抑制率高达73.22%。由于灵芝的野生资源日渐稀缺，子实体人工栽培周期长，价格因素影响了灵芝相关产品的大规模推广；因此，基于液体深层发酵法生产灵芝相关活性物质已成为研究热点。

前期研究中，张周美等[12]利用菌丝体深层发酵技术获得了灵芝发酵液，经检测，证实其具有良好的美白效果。本研究中，以评价美白功效的酪氨酸酶抑制率为主要检测指标，探究灵芝液体深层发酵技术的最优生产工艺，通过基于质谱的代谢组学技术对发酵液中的主要成分进行分析，明确发酵液中的主要活性成分与美白功能之间的关系，旨在探讨灵芝发酵液是否能作为低成本、纯天然功效原料来替代传统的灵芝子实体发酵液或提取液在化妆品中进行应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供试菌株A-1916 由江苏高邮市科学食用菌研究所提供。

1.1.2 培养基

斜面培养基：马铃薯 20 g(去皮)，葡萄糖 2 g，琼脂2 g，蒸馏水 1000 mL，121 ℃灭菌20 min。

平板培养基：MEA 培养基，购自青岛日水生物技术有限公司，115 ℃灭菌30 min。

初始发酵培养基：麦芽浸粉 2 g，葡萄糖 2 g，胰蛋白胨 0.1 g，酵母膏 0.1 g，121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌种的培养

无菌条件下将菌株(1 cm×1 cm)转接至斜面培养基中，30 ℃避光培养5 d 后再转接至平板培养基，30 ℃避光培养5 d。平板种子接入灭菌后的液体培养基中，30 ℃、160 r/min 避光振荡培养6 d，9000 r/min离心30 min 后收集上清液并进行代谢组分析，检测多糖和三萜含量，计算酪氨酸酶抑制率。

1.2.2 发酵培养基的优化

按表1 分别配置4 种培养基。100 mL 分装，无菌条件下接种3 块菌丝块，30 ℃、160 r/min 避光振荡培养 4 d，过滤。分别测定发酵液酪氨酸酶的抑制率。每种培养基重复3 次。

表1 供试培养基的配方Table 1 Different medium formulations

1.2.3 生长条件的优化

以1.2.2 优化后的培养基为液体发酵培养基，进行单因素试验，分别设置不同培养天数、温度梯度和pH 梯度，于160 r/min 摇床避光振荡培养，离心，过滤，测定发酵液酪氨酸酶的抑制率。

1.2.4 发酵液代谢组学的分析

1 mL 发酵液中加入甲醇配置的内标(含L-2-氯苯丙氨酸(0.3 mg/mL)、C-17(0.01 mg/mL))20 μL，冻干；用300 μL 的甲醇和乙腈混合溶液(甲醇与乙腈的体积比为2∶1)复溶，涡旋30 s，在冰水浴中超声提取5 min；低温离心10 min(13 000 r/min，4 ℃)，用注射器吸取200 μL 的上清液，用0.22 μm 的有机相针式过滤器过滤后转移至LC 进样小瓶，-80 ℃下保存，用于LC- MS 分析。

采用Waters ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪进行处理。色谱条件如下：色谱柱，ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；柱温，45 ℃；流动相，A 相，水(含0.1%甲酸)，B 相，乙腈(含0.1%甲酸)；流速，0.4 mL/min；进样体积，2 μL。采用正负离子扫描模式分别采集样品质谱信号。每10 个分析样本中插入1 个质控样本，以考察整个分析过程的重复性。获得原始数据后对数据进行生物信息分析，对所有样本的总离子流图进行可视化检查。在模式识别之前进行数据预处理。原始数据经代谢组学处理软件 progenesis QI 进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化后得到具有保留时间、质荷比和峰强度的代谢物鉴定数据矩阵。

1.2.5 酪氨酸酶抑制率测定方法

参照田春龙[13]的方法，按表2 配置4 组溶液。加入PBS(0.2 mol/L、pH 6.8)、酪氨酸酶(200 U/mL)、样液后混匀，37 ℃恒温水浴10 min 后分别加入1 mL 的L-酪氨酸(0.15 mmol/L)，在37 ℃下反应10 min，最后在冰水中迅速冷却，使用多功能酶标仪测定475 nm 下4 组样品的吸光值。按公式(1) 计算酪氨酸酶活性抑制率。

表2 酪氨酸酶活性抑制试验体系Table 2 Experimental system of tyrosinase inhibition

式中：K为酪氨酸酶活性抑制率；K1、K2、K3、K4分别为A1、A2、A3、A4溶液在475 nm 处的吸光度。

1.2.6 胞外多糖和三萜的提取与测定

胞外多糖通过3 倍体积的95%乙醇进行醇析提取；采用苯酚硫酸法测定发酵液中多糖的含量；参照文献[14]提取灵芝三萜；采用香草醛-高氯酸显色法测定样品的三萜含量[15]。

1.3 数据处理

运用Excel 2013 进行数据整理、方差分析和相关性分析；采用SPSS 对不同处理条件下酪氨酸酶抑制率差异显著性进行统计分析；采用GraphPad Prism 9 绘图。

2 结果与分析

2.1 灵芝液体深层发酵培养基及培养条件的优化

从图1-A 可以看出，麦芽浸粉培养基1 的发酵效果最佳，酪氨酸酶抑制率达83.54%，显著高于其他3 种培养基的抑制率(P＜0.05)。采用优化好的培养基1 进行后续试验，结果 (图1-B)表明，随着培养时间的延长，灵芝发酵液酪氨酸酶抑制率逐渐升高，在第6 天达到最高值(90%)。从图1-C 可以看出，灵芝发酵液酪氨酸酶抑制率与温度相关，在15～30 ℃，随着温度的升高，发酵液酪氨酸酶抑制率逐渐升高；在30 ℃时，酪氨酸酶抑制率最高，达94.21%；＞ 30～35 ℃，随着温度的进一步升高，发酵液酪氨酸酶抑制率逐渐降低。此外，灵芝发酵液的酪氨酸酶抑制能力受初始pH 的影响较大，在适宜菌丝生长的范围(pH 3～7)内，其发酵液的酪氨酸酶抑制率相对较高；在pH 值为5 时，酪氨酸酶抑制率达最大值(95.1%)。

图1 不同培养基配方、发酵时间、发酵温度以及发酵液初始pH 下灵芝发酵液的酪氨酸酶抑制率Fig.1 Tyrosinase inhi bition r ate o f G.lucidum fe rmentation br oth u nder diffe rent medium form ula, fe rmentation time, f ermentation temperature and initial pH

2.2 灵芝发酵液代谢组学分析

采用LC-ESI-Q-TOF 非靶向代谢组学方法对发酵液中主要活性成分进行分析。通过数据库搜索，共鉴定出212 种有功能注释的活性成分。对这些活性成分进行功能分类，发现灵芝三萜种类有30种(表3)，灵芝多糖种类有26 种(表4)，核苷酸有12 种，氨基酸有13 种，其余的为其他活性成分。

表3 灵芝发酵液中鉴定的30 种三萜的基本性质Table 3 Basic properties of 30 triterpenes identified in G.lucidum fermentation broth

表3(续)

表4 灵芝发酵液中鉴定出的多糖的基本性质Table 4 Basic properties of polysaccharides identified in G.lucidum fermentation broth

2.3 灵芝三萜、多糖含量与灵芝发酵液酪氨酸酶抑制作用的相关性分析

对发酵液中灵芝多糖和三萜含量及酪氨酸酶抑制率进行测定。结果表明，发酵液中灵芝多糖含量为24.8 mg/g，三萜含量为55.7 μg/mL，多糖和三萜提取率分别为74.5%和75.9%。发酵液原液酪氨酸酶抑制率为95.1%；三萜类提取物的酪氨酸酶抑制率为69.87%，多糖提取物的酪氨酸酶抑制率为26.74%。说明发酵液中具有美白活性的成分主要为灵芝三萜。

对发酵液中灵芝多糖和三萜含量与酪氨酸酶抑制率的相关性进行分析，结果(图2)表明，灵芝三萜对酪氨酸酶抑制率影响显著，灵芝三萜含量与酪氨酸酶抑制率呈线性相关，其相关系数R2=0.983 7，而多糖含量与酪氨酸酶抑制率之间没有明显的相关性。说明通过本工艺生产的灵芝菌丝体深层发酵液中的主要美白功能性物质为三萜类化合物。

图2 发酵液中灵芝三萜含量、多糖含量与酪氨酸酶抑制率的相关性Fig.2 Correlation a nalysis between G. luc idum triterpene a nd polysaccharide c ontent and t yrosinase inhi bition r ate in fermentation broth

3 结论和讨论

本研究结果表明，具有美白活性的灵芝发酵液最佳培养条件为：麦芽浸粉2 g/mL，蔗糖1.72 g/mL，豆粕粉0.214 g/mL，酵母提取物0.1 mg/mL，pH 5，温度30 ℃，培养时间6 d，转速160 r/min。在此条件下，发酵液酪氨酸酶抑制率为95.1%。通过代谢组学技术鉴定出包括多糖、三萜、核苷酸和氨基酸等在内的212 种成分，其中，多糖和三萜的种类最多，分别鉴定出26 种和30 种。发酵液三萜含量与酪氨酸酶抑制活性呈正相关，而多糖含量与酪氨酸酶抑制活性无明显的相关性，表明发酵液中的主要美白因子为灵芝三萜。

现市面上常见的化妆品美白功能性原料可分为化学合成类和天然类。合成类美白剂能快速美白，但其自身所存在的安全性问题使其在化妆品中的使用受到极大限制[16]。由此，从天然产物中寻找安全高效的美白活性物质已成为化妆品行业研究的热点，已经成为美白化妆品的发展方向[17]。目前美白功效明确且应用最多的天然产物来源包括人参、甘草、葛根、当归、川芎、灵芝等[18-20]。近年来，对以灵芝为基础的化妆品原料研究和应用相对较多。研究[21]发现灵芝菌中含有1 种黑色素降解酶，可以对合成的黑色素进行降解。然而，灵芝生长需要数月乃至一年时间，同时病虫害、栽培水平也大大制约着灵芝子实体的生产水平[22]。目前，灵芝深层发酵的研究主要集中在提高灵芝多糖、三萜产量及发酵液抗氧化特性方面，而对于其发酵液美白功效的研究却相对较少。

目前从灵芝孢子粉和子实体分离得到的三萜类化合物有上百种[23]，但对菌丝体的三萜种类及其具有美白功能的关键成分研究相对较少。研究[24]结果表明，灵芝萜酮二醇可抑制黑色素的合成。但是灵芝发酵液中三萜类美白功能性成分尚少见报道。本研究中，通过代谢组学技术鉴定了包括多糖、三萜、核苷酸和氨基酸等在内的212 种成分。其中，多糖和三萜的种类最多，进一步证实了三萜类物质为灵芝发酵液的主要美白成分。由于三萜类有30种，每种三萜的美白效果如何有待进一步研究。