赵为民，涂枫，王泽平，程金花，付言峰，李碧侠，任守文*

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京 210014；2.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014；3.农业农村部种养结合重点实验室，江苏 南京 210014；4.江苏省农业科学院宿迁农科所，江苏，宿迁 223800)

Inhba基因是构成转化生长因子TGF-β 超家族成员激活素和抑制素的亚基单位，可通过自分泌和旁分泌的形式调控卵泡的生长发育及促卵泡激素(FSH)与促黄体素(LH)的生成[1-3]。研究[4-5]报道Inhba基因的表达量和多态与羊的产仔数性状紧密相关，可能是控制山羊高繁殖力性状的主效基因。因而，深入解析Inhba基因的功能可为进一步利用Inhba基因在家畜上的育种价值提供依据。

CRISPR/Cas9 系统是细菌和古细菌为抵抗外源病毒入侵所进化的一种适应性免疫防御系统。它通过小段RNA(sgRNA)与宿主DNA 识别并借助Cas9核酸酶对基因进行高效的靶向编辑[6-7]。相比于传统的同源打靶、ZFN 和TALEN 等基因编辑方法，以CRISPR/Cas9 系统为代表的编辑系统使用高效简便，已被广泛应用于医学及动物、植物育种等领域。研究[8-15]表明，在高等生物(人、动物、植物)中，CRISPR/Cas9 系统相继对人、小鼠、斑马鱼、水稻、烟草、油菜的基因都进行了有效的编辑，成为疾病治疗、基因功能研究与培育新品种的重要工具。

大鼠作为模式动物在基因功能研究方面起着重要作用。本研究中，利用CRISPR/Cas9 系统来筛选验证针对Inhba基因有效的sgRNA，旨在为后续制作个体水平的Inhba基因敲除大鼠，深入解析Inhba基因在卵泡发育的分子机理提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

Trans5α 感受态菌株购于北京全式金生物技术有限公司；大鼠L6 细胞购于中国医学科学院基础医学研究所；PX330 载体由农业农村部种养结合重点实验室保存。

1.2 主要试剂

DNA 提取试剂盒购于北京擎科生物科技有限公司；限制性内切酶BbsⅠ、T7E1 酶购于NEB；T4 连接酶、DNA Marker、DNA 聚合酶PrimerSTAR Max Premix 购于 Takara；pEASY-Blunt Simple Cloning kit 购于北京全式金生物技术有限公司；无内毒素质粒试剂盒购于康为世纪生物科技有限公司；DNA 纯化回收试剂盒购于Zymo Research；DMEM 培养基购于武汉博士德生物工程有限公司；青链霉素、胎牛血清、opti-MEM 和Lipofectamine®3000 购于Thermo Fisher。

1.3 Inhba 基因的sgRNA 设计

在NCBI登录号为NM_017128的序列中提取大鼠Inhba基因mRNA序列的编码区，运用在线软件(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计sgRNA靶标位点[16]。首先考虑Off-targets指标，选取的sgRNA序列位点尽量没有Off-targets所述的0、1、2、3错配类型；然后考虑Efficiency(＞50%)的sgRNA，最后综合Selfcomplementarity(数值尽量为0)和GC含量(40%～60%)筛选sgRNA-inhba序列。

1.4 PX330-Inhba-sgRNA 质粒构建

按照sgRNA-Inhba 的序列合成反向互补的单链寡核苷酸sgRNA-Inhba-F 和sgRNA-Inhba-R，并在sgRNA-Inhba-F的5′端添加CACC，在sgRNAInhba-R 的5′端添加AAAC。通过95 ℃变性5 min，室温冷却，将sgRNA-Inhba-F 和sgRNA-Inhba-R退火互补。采用BbsⅠ酶切px330 载体，琼脂糖凝胶回收纯化后与退火的寡核苷酸连接。将连接产物转化到Trans5α 的感受态细胞中，挑取LB 培养基平板上生长的单克隆菌落送至北京擎科生物科技有限公司测序验证，测序正确的菌液进行扩增后提取无内毒素质粒。

1.5 细胞培养与质粒转染

将大鼠L6 细胞培养在含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM 培养基中，置于37 ℃、5% CO2中培养，每2 d 换1 次培养液，汇合度达到80%时进行细胞消化与传代。

转染前1 d 将L6 细胞铺在12 孔板中，质粒转染按照Lipofectamine®3000 说明书的方法进行。在EP 管中，用opti-MEM 稀释PX330-sgRNA-Inhba质粒和P3000TM，充分混匀；另一EP 管中，用opti-MEM 稀释Lipofectamine®3000，将2 管充分混匀，于室温下放置15 min，滴加入细胞中继续培养48～72 h。

1.6 基因编辑验证

提取转染 PX330-sgRNA-Inhba(试验组)与PX330 载体(对照组)的细胞DNA，通过PCR 扩增基因编辑区域，引物分别为5′-GACTTTTGCTGCCA GGATGC-3′(F)、5′-CGCCACCATCACCACCTAA-3′(R)，扩增大小为536 bp。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR 扩增体系：Mix 10 μL，F、R 引物各0.5 μL，DNA 1 μL，用ddH2O 补齐至20 μL。扩增条件：94 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，33 个循环；72 ℃延伸1 min。

回收纯化PCR 产物后，对PCR 产物进行梯度变性，程序为：95 ℃变性5 min；95～85 ℃，每秒降低2 ℃；85～25 ℃，每秒降低0.1 ℃。利用T7E1酶切PCR 产物，酶切反应体系为10.5 μL 上述PCR产物加0.5 μL T7E1，37 ℃反应30 min。酶切产物于2%琼脂糖凝胶上进行电泳显带。

将扩增转染PX330-sgRNA-Inhba(试验组)和PX330 载体(对照组)的 PCR 回收纯化产物与pEASY-Blunt Simple Cloning kit 载体进行连接，体系为1 μL pEASY-Blunt 载体加4 μL PCR 产物，25 ℃反应10 min。将此5 μL 连接产物转化到Trans5α 的感受态细胞中，随机挑选20 个克隆送至北京擎科生物科技有限公司测序，并计算有序列突变的克隆数占总克隆数的比例，从而估算 pX330-InhbasgRNA-2 载体对Inhba基因的切割效率。

2 结果与分析

2.1 Inhba 基因的sgRNA 序列

Inhba基因位于17号染色体的反义链，有3个外显子，第一外显子较短，仅为57 bp，并且不编码蛋白，因此，不考虑此外显子；考虑到尽量在基因的前中部进行基因编辑，以此达到敲除基因的目的，在Inhba基因的第二外显子设计sgRNA(图1)。序列为：GGCAAAGGTGATGATCTCCGAGG，PAM为AGG。此sgRNA位于17号染色体，GC含量为57%，在Off-target 0、1、2、3的参数上均为0，预期切割效率为57%，符合预期要求。

图1 Inhba基因的sgRNA位置Fig.1 Schematic diagram of the sgRNA location in the Inhba gene

2.2 L6 细胞的转染效率

图2-a 显示了大鼠L6 细胞转染后的明场状态；图2-b 显示了L6 细胞转染后呈现的绿色荧光。对比明场状态，L6 细胞的转染效率较高，可用于PX330- Inhba-sgRNA 质粒的转染与后续分析。

图2 大鼠L6 细胞的pEGFP-N1 转染效率验证结果Fig.2 Verification result of pEGFP-N1 transfection efficiency in L6 cells of rat

2.3 PX330-Inhba-sgRNA 的T7E1 切割验证

从图3 可知，试验组536 bp 的产物被切割为大约386 bp 和150 bp 的条带，出现了预期的切割条带；阴性对照组没有切割出条带。

图3 PX330-Inhba-sgRNA 切割效率的T7E1 验证结果Fig.3 Verification result of PX330-Inhba-sgRNA cleavage efficiency by T7E1

2.4 PX330-Inhba-sgRNA 的切割效率

将pX330-Inbha-sgRNA(试验组)的Inhba基因的编辑区域PCR产物连接T载体后，随机选取20个单克隆测序，发现有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失(图4)，其中1个克隆缺失了6个碱基，是3的整数倍，其余的分别缺失2、5和13 个碱基。估测pX330-Inbha-sgRNA 载体利用CRISPR/Cas9系统在细胞水平上对Inhba基因的切割效率为25%。

图4 PX330-Inhba-sgRNA 切割效率的克隆测序结果Fig.4 Cloning sequencing result of PX330-Inhba-sgRNA cleavage efficiency

3 结论与讨论

sgRNA 本身较短，长度仅约20 bp，在基因组上容易匹配到多个位置，从而造成脱靶效应[17]。本研究中，选取的sgRNA 序列位点的Off-targets 所述的0、1、2、3 错配类型都为0，而0、1、2、3分别代表在基因组上的错配0～3 个碱基数量的sgRNA 个数，说明选取的sgRNA 靶标位点在大鼠基因组上高度特异。研究[18]表明，sgRNA 在错配多个碱基的情况下其切割效率很低，本研究的Inhba-sgRNA 在脱靶性上也非常低。

CRISPR/Cas9 系统中的sgRNA 引导Cas9 核酸酶在基因组DNA 的靶标位点上对靶基因进行DNA链切割后，往往会优先启动非同源末端连接(NHEJ)修复DNA 片段，从而在切割位点伴随着碱基对的随机插入或缺失[19]，造成该基因翻译的移码或提前终止，达到敲除基因的目的。本研究中，针对Inhba第二外显子设计的sgRNA，首先通过T7E1 验证，发现T7EI 对基因编辑区域的PCR 产物能切割出预期条带，说明设计的sgRNA 是有效的；另一方面通过T 载体克隆测序发现有5 个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失，表明sgRNA 成功编辑了Inhba基因的第二外显子。在编辑的类型中，除了其中1 个克隆是缺失了3 的整数倍碱基，其余的缺失2、5 和13 个碱基，导致Inhba基因的翻译出现移码，从而造成该基因功能异常和缺失。综上可知，本研究中，筛选的Inhba-sgRNA 能有效的编辑Inhba基因，该sgRNA 能为后续制作个体水平的Inhba基因敲除大鼠提供依据。