徐铭阳，李 崎，任 涛，郑飞云，王金晶，钮成拓，刘春凤

（1.江南大学，生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122；2.江南大学，酿酒科学与工程研究室，江苏无锡 214122）

现如今，啤酒在中国的生产总量已经在世界排行第二，但是对于啤酒的品质和老化控制等方面同发达国家相比较还有着不小的距离[1]，致使我国的啤酒行业在国际上的竞争力较弱。而风味稳定性一度被认为是评判啤酒品质最主要的指标，同时也是影响其保质期长短的重要原因，所以提升啤酒的风味稳定性，对啤酒风味的老化进行缓解是啤酒行业目前最重要的课题之一，也是高质量啤酒酿造的核心所在。

啤酒的老化是一个十分复杂的过程，从原料、酿造过程、包装、贮存到货架期的各个阶段都对成品啤酒的风味稳定性有着不同程度的影响[2]。麦芽中含有的一些能催化氧化多酚、不饱和脂类等物质的氧化还原酶系，会使风味老化前驱物质含量增加，降低啤酒的抗氧化力，从而对啤酒的非生物稳定性和风味稳定性造成不良影响[3]。啤酒酿造的主要阶段是制麦、糖化、煮沸和发酵，其中制麦和糖化阶段是一个抗氧化力上升的阶段，同时伴随氧化还原酶的形成，致使大量老化相关前驱物质产生[4]，麦芽和麦汁的抗氧化力直接与成品啤酒的风味稳定性相联系，啤酒整个生产过程中对抗氧化力的提升，会在啤酒老化前驱物的抑制和风味稳定性的提升等方面有着显著影响。

1 啤酒酿造中的氧化还原酶系

啤酒的酿造原料主要是大麦麦芽，麦芽中的还原力在啤酒的整个生产过程中都发挥着重要作用。而大麦麦芽中的氧化还原酶主要包含脂肪酸氧化酶（LOX），过氧化氢酶（CAT），多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）[5]。在啤酒酿造的过程中会受到内源性氧化还原酶促伴随着许多复杂的反应，使得老化物质含量上升从而麦芽的抗氧化能力减弱，进而对啤酒的风味和外观品质产生不利影响。

1.1 脂肪氧化酶（LOX）

脂肪氧化酶（lip oxidase，简称LOX）又称脂肪氧合酶，能催化如亚油酸和亚麻酸等有着顺，顺-1,4-戊二烯结构的脂肪酸，和氧气发生加合反应产生氢过氧化物[6]。LOX 能转化大部分脂类为败坏醛类的前体物质，释放出不饱和脂肪酸，例如亚油酸，进而利用氧使亚油酸生成为氢过氧化脂肪酸，再通过过氧化物异构酶使得氢过氧化脂肪酸进一步反应，生成了乙酮醇，乙酮醇最后会被分解形成有着老化味道的醛类。具体催化反应过程见图1。

图1 LOX催化的脂类转化反应[7]

麦芽等啤酒生产原料中含有的脂类很多，故在啤酒的储存中脂肪酸氧化是对风味老化最不利的因素之一[8]。对于脂肪氧化酶的研究国外开展较早，研究发现大麦在浸泡阶段以后，其LOX 的酶活会受到抑制，但是在发芽时酶活的上升明显，最终会达到大麦原有的5 倍，在烘焙阶段其活性又显示出明显减弱的趋势，结束后甚至会比原有大麦的LOX 活性还要低[9]。麦芽中的LOX 在通常糖化工艺条件下仍有催化活性，使得不饱和脂肪酸被催化氧化从而生成老化前驱物质，且Takoi 等[10]认为LOX 主要在糖化时发挥作用。但文献报道发现，当麦汁在70 ℃下保温15 min 后LOX 活力会丧失，同时也可采用在糖化中通入CO2或者N2的方法来降低LOX的作用[11]，进而减弱其对啤酒抗氧化力的不良影响。

1.2 过氧化氢酶（CAT）

过氧化氢酶（Catalase，简称CAT）来源丰富，几乎全部的好氧生物和一些厌氧生物中都有其存在[12]，啤酒酿造用大麦中也含有CAT 酶系。过氧化氢与游离羟基的产生有着密切联系，可对动植物细胞产生损害，同时对啤酒的稳定性和抗氧化性有着不良影响[13]，故在好氧系统广泛存在的酶中拥有能消除过氧化氢的酶是很重要的。CAT 能催化H2O2分解为H2O 和O，使氧得以维持在基态状态，使食品保鲜，所以CAT 可作为抗氧化剂添加到啤酒、饮料中来清除分子氧、活性氧和自由基[14]，提高啤酒的抗氧化力。另一方面，大麦中所含有的CAT在发芽阶段活性上升，但其仅能承受较低的焙烤温度，于深色麦芽的加工过程中CAT 酶活已遭受严重损失[15]。糖化过程中的相关研究表明，CAT 在56 ℃糖化时酶活性基本丧失，因此并不能消除糖化早期所产生的H2O2，故在糖化过程中CAT的影响可以忽略[16]。

1.3 酚类氧化酶——PPO与POD

在啤酒酿造过程中的酚类氧化酶主要包括多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)。在H2O2或（和）O2存在的条件下，麦汁中的酚类物质通过PPO和POD 的催化氧化后具有类似单宁类性质（图2），可以与蛋白质发生交联反应而产生混浊[17]，这一方面会减少麦汁中的酚类物质和产生老化前驱物质，进而减弱麦汁的抗氧化力，另一方面啤酒酿造系统中的活性氧和自由基也会得到清除，从而可以改善啤酒的非生物稳定性和风味稳定性[18]。

通常认为，在啤酒酿造中PPO是麦汁制备过程中对多酚氧化作用的最主要的酶，但Clarkson 等[20]研究可知麦芽中PPO的活性很低，同时由于大麦和麦芽中的POD 具有同功酶多、酶活性和热稳定性强等特征，这使得PPO 氧化多酚的活性远低于POD，因此POD 成为麦芽糖化过程中氧化多酚最主要的酶[21-23]。

综上所述，内源性的氧化还原酶在啤酒生产过程中会伴随着许多的反应，会生成许多的老化前驱物质，同时也会使内源性还原物质含量下降。作为一类促进氧化作用的酶，LOX、CAT、POD和PPO会对啤酒的稳定性和风味产生许多积极或消极作用，特别是对于制麦和糖化等啤酒生产的上游阶段，在对酚类物质的氧化和生成混浊前体物质等方面有着重要的影响。但同时麦芽中的氧化还原酶因为其复杂的作用底物和反应过程，在各酶系对啤酒酿造的影响方面还存在较大争议[24]。其中，POD 是一把双刃剑：一方面，由于POD 具有良好的耐热性而存在于啤酒酿造的流程中清除活性氧，对由多酚和高分子蛋白质聚合造成的浑浊问题具有积极的改善作用；另一方面，POD 在啤酒生产过程中的催化反应与多酚的氧化紧密相关，间接消耗啤酒中的多酚类抗氧化物质含量，在某种程度上会导致啤酒抗氧化力的下降，带来啤酒老化的风险。因此，如何合理地控制啤酒酿造过程中POD 的活性，对于减少浑浊前体物质、保留内源性抗氧化物质、延长啤酒风味保鲜期具有重要的意义。

2 POD对啤酒抗氧化力的影响

2.1 POD氧化多酚的作用机制

POD 是酚类氧化酶中的一个重要构成部分。POD广泛出现于植物中，在植物的生理成长中有着不可或缺的地位，能消除H2O2，同时可以预防自由基对植物本身造成的伤害，加快木质素形成和根的生长[25]，已有研究表明在大麦子粒中检验出POD的16 种同功酶，绿麦芽中存在20 种，焙燥阶段结束后只剩15 种，不同大麦品种中的POD 同功酶于胚乳和其外层中有着差异，但是POD 在胚中的差别是相对小的[26]。

如图3 所示，POD 在多酚和H2O2存在的条件下，启动整个自由基链的一系列反应。当O2进入酿造体系后POD 能使多酚被酶促氧化而产生很多醌类，而醌类物质可以和蛋白质产生凝聚，隔断蛋白质的亲水基团而生成沉淀，破坏了胶体的平衡，从而使麦汁的内源性抗氧化力下降，最终会对啤酒的非生物稳定性有不利影响[27]。与此同时，POD 能显著去除麦汁中的多酚物质，使麦汁的色度减弱，但因此也会导致多酚聚合指数和老化前驱物含量(TBZ)的增加，以及抗氧化力的明显减弱。

糖化阶段中POD 在H2O2和O2存在的前提下，会启动氧化还原底物多酚的反应，其作用主要在多酚物质的含量和抗氧化力的降低、麦汁过滤速率的下降、浊度和色度明显增加等方面体现，这主要的原因是多酚被POD 催化氧化后，多分子聚合物会由氧化的产物和戊聚糖交联反应而形成，从而致使麦汁的抗氧化力下降，因此POD 清除多酚物质的效果显著，且其优势是以吸附的形式取代对多酚物质的氧化来达到消除的目的[29]。

2.2 啤酒酿造中的POD与活性氧

啤酒老化的重要原因是啤酒中活性氧引发的氧化反应。研究表明，分子态氧没有十分显著的反应活性，但是在金属离子存在的情况下，分子态氧会被激活生成活性氧(O2-，OH-，H2O2，OOH·)，这些活性氧拥有着很高的反应活性，从而能引发一系列复杂的自由基反应使得啤酒的风味发生老化[30]。啤酒生产各阶段中会尽可能地缩减酒中氧气的量，伴随着啤酒灌装设备技术的进步，现在已经可以将啤酒瓶中的氧气含量降到0.1 mg/L 以下，但是现阶段活性氧仍然会使啤酒在储藏过程中发生老化[31]。

活性氧在啤酒酿造中的主要消耗路径是在糖化阶段中通过POD 催化的氧化反应和在煮沸阶段时麦汁中多酚的非酶氧化。当分子氧存在时，POD能催化多酚的氧化反应，使麦汁的还原力降低，但在麦汁糖化时的质量和内源性抗氧化力等方面所产生的负面作用不是特别明显，相反麦汁的质量却有了一定的提升[32]，例如抗氧化活力提高，TBZ 值降低等[33]，这表明POD或许在糖化阶段对过氧化物和活性氧自由基有着清除作用，抑制羰基化合物的形成。因此，在糖化阶段中限制分子氧的提供，麦汁里存在的POD 能对生成的过氧化物和活性氧自由基进行消除，而使麦汁的质量和内源性抗氧化力得到提升。

同时作为一类效果显著的抗氧化酶，POD对于消除活性氧有十分明显的效果，在人体中有着不错的预防疾病和保健功能[34]，POD 在影响啤酒的非生物稳定性、改善其风味、增强啤酒的保健功能等方面同样具有潜在的应用价值。

3 啤酒酿造中过氧化物酶的变化与控制

大麦麦芽作为啤酒的生产原料，其所含有的内源性过氧化物酶及多酚类物质对啤酒生产过程中的抗氧化力和成品啤酒的质量有重要影响，麦芽的原本的组织和细胞结构于制作麦汁过程中的粉碎阶段被破坏，给酶促氧化多酚的反应提供了水、温度和氧等一系列有利条件，褐变和聚合反应也会由此而发生，从而麦汁的色泽品质和风味特征会发生改变，同时多酚的含量和啤酒的抗氧化力会降低，进而影响到啤酒的风味和非生物稳定性[35]。而在一定条件下，POD 又能有效清除过氧化物和活性氧，从而可提升啤酒的抗氧化力。因此深入研究过氧化物酶，探明其作用机理，掌握其在啤酒酿造过程中的变化规律，通过对各方面的影响因素的探究来控制过氧化物酶的影响，进而提高啤酒的抗氧化力，对啤酒质量的提升会有重要的指导意义。

3.1 酿造过程中的POD和抗氧化力变化

3.1.1 制麦过程

制麦是啤酒酿造过程中内源抗氧化力得以提升的重要阶段。首先，浸麦阶段酚类物质含量显著增加，并随着麦芽的溶解和破碎而游离并带入到麦汁中，从而抗氧化力得以提升[36]。而POD 是一类在大麦中少量存在、性质相对较为稳定的氧化还原酶类，在发芽期间大麦的POD 活性增长很快，且与α-淀粉酶活力的增加呈同步趋势[37]。研究表明在制麦过程中，大麦为氧化还原酶的生成、增长和作用提供了有利的内部条件，使得POD活力上升，到发芽结束后酶的活性增加了5 倍左右，POD活性与根茎长短与制麦损失均展示出十分明显的正相关[38]，同时在不同品种大麦中，POD 也有着较大的差异[39]。

3.1.2 糖化过程

从啤酒酿造的整个流程来看，由于麦芽中的POD 活性高、热稳定强，在糖化阶段中对多酚物质的催化氧化反应进行得最为强烈，原因是在这阶段特别是糖化前期，其具备酶促氧化反应所需的酶、底物、水分、温度和氧等基础条件[40]。在糖化阶段，随着糖化时间的延长和温度的上升POD 的酶活也随之减弱，但由于POD 良好的热稳定性致使其酶活会于糖化整个过程的酸休止、蛋白质休止、糖化分解和糖化终结阶段存在，为酶促氧化多酚物质提供了有利的前提[41]。同时，糖化阶段中进入体系中的氧被金属离子诱导而激活整个反应链，POD 在H2O2存在的情况下氧化多酚产生老化前驱物质，导致糖化过程中麦汁色度增加，产生沉淀，从而使麦汁的品质下降。此外在糖化阶段中麦芽的POD 活性会有一定的下降，剩余的POD 在H2O2存在的条件下，会在多酚存在的前提下进一步氧化，带来消极作用[42]。多酚类物质含量的下降，减弱了部分麦汁还原力，使得麦汁中的抗氧化力随之下降，进而对成品啤酒的稳定性产生不良影响。

3.1.3 煮沸过程

在煮沸阶段随着热负荷增加，POD 凭借其良好的耐热性和稳定性，在此阶段初期会加速多酚氧化[42]，但随着煮沸过程的推进，POD 活力会得到明显遏制，研究表明，煮沸阶段结束后POD 的酶活为0[26]。酒花是啤酒中多酚物质的主要来源之一，煮沸过程中酒花的加入会明显提高麦汁的抗氧化力，但麦汁受到热负荷不断增加的影响且发生的美拉德反应使类黑精和多酚反应产生高级醇[43]，致使煮沸60 min 后麦汁还原力下降明显，现有研究表明，经测定煮沸过程后麦汁总的抗氧化力并没有明显变化[44]。

3.1.4 发酵过程

啤酒酵母菌株在发酵过程的影响占主导地位[45]，POD经过煮沸阶段受过量热负荷影响丧失酶活，故POD 对麦汁的影响在此阶段可忽略不计。而酵母中含有内源性谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），其主要作用在胞内抗脂质过氧化作用保护系统[46]，目前还未发现酵母中GSH-Px 对啤酒抗氧化力影响的研究报道。在发酵阶段多酚会伴随麦汁温度的下降、pH 值的下降和酵母聚集沉淀而析出，但麦汁中还原物质的总量并没有降低，主要因为啤酒酵母在代谢过程中可生成例如还原型谷胱甘肽（GSH）的代谢产物有着抗氧化的作用[47]。在啤酒发酵过程中，由酵母代谢到发酵基质中的GSH，能够清除啤酒中一定量氧自由基的累积，且对于啤酒香气损失和外观品质变化有预防作用，使其成为此阶段提升啤酒的抗氧化力的主要因素[48]。同时发酵阶段中的酵母接种量、发酵温度和贮酒温度等因素都会影响啤酒的抗氧化力和风味稳定性[49]。

3.2 酿造过程中POD的控制

新鲜啤酒因其特殊的风味，清爽的口感得到广泛的热爱，但在储藏期间成品啤酒都会因啤酒的氧化过程而产生异味，我们通常用“老化味”来形容这些异味[50]。POD 在酿造过程中可以通过与多酚反应和清除自由基来影响啤酒的抗氧化力，因此可以通过控制酿造中POD 的活力来提高啤酒的抗氧化力，延长啤酒的货架期。

在啤酒酿造过程中，溯源影响POD 活性的因素是大麦的品种，此外制麦工艺的不同也会造成POD酶活的差异，控制制麦过程各工艺条件是调节氧化还原酶活力最主要的手段，由于POD 活力主要在制麦过程中得以显著增长，适当改变制麦中焙燥阶段的工艺可以达到控制成品麦芽中POD 活力的目的[51]。过氧化物酶在麦芽的焙燥阶段会失去一部分酶活，焙焦温度越高，酶活下降就会越多，因POD 良好的耐热性，当焙焦温度控制在80 ℃以下时，麦芽的POD 酶活力变化不大，但焙焦麦芽的温度达到82 ℃时，POD 的酶活下降迅速，说明焙燥阶段中POD 对82 ℃十分敏感，其在82 ℃将会失活，同时考虑其他酶系的影响焙焦温度选择在78～82 ℃便可控制过氧化物酶的活力[52]。而CN-、S-、F-、-N3、NH2OH、OH-以及SO32-等对POD 产生可逆性抑制作用；浓酸或H2O2会对POD 产生不可逆性抑制[53]。同时Omidiji 等[54]研究发现，在高粱发芽阶段中添加NH4Cl、KCl、CaCl2、FeCl3等不同的无机盐类，这些盐类不仅会对发芽有影响，同时也会对POD也有着或多或少的抑制作用[55]。

4 小结与展望

大麦和麦芽中的氧化还原酶系可以在啤酒酿造过程中通过催化氧化不饱和脂类和多酚等物质来产生羰醛化合物等风味老化前驱物，可使成品啤酒的抗氧化能力减弱，从而对其非生物稳定性和风味稳定性有着重要意义。

POD是一类促氧化剂，与另外的氧化原酶类相比较，各方面的性质十分稳定，且可以承受较高的焙焦温度和糖化温度，其主要的酶活在制麦阶段中产生。多酚是麦汁抗氧化物质的主要来源之一，在煮沸过程中POD 可利用多酚作为底物发生氧化，而热负荷能使老化前驱物的生成和麦汁抗氧化力的降低速度加快，在成品啤酒内这些老化相关物质会发生诸多反应而进一步影响啤酒的风味。同时POD 以多酚和H2O2为底物引发的一系列反应，使得胶体平衡破坏，有效降低多酚含量，麦汁抗氧化力减弱，降低麦汁色度，而在限制分子氧的前提下，POD对清除过氧化物和活性氧还有着重要贡献，从而可提升啤酒的抗氧化力。目前对于POD 的研究多在于其特性和制麦过程中的含量变化，但对于两种氧化机制下POD 对啤酒抗氧化力的贡献度方面研究较少，因此，明确POD 对啤酒抗氧化力的主要作用途径并通过对POD 的调控来增强啤酒的抗氧化性能，有利于提高啤酒的风味稳定性、提升啤酒品质、促进啤酒产业的健康发展。