童天娇，刘 伟，胥鑫萌，李恒睿，刘军海

（陕西理工大学化学与环境科学学院，陕西 汉中 723000）

近年来国内外学者在对秦皮的大量研究中发现，秦皮具有极高的临床药用价值[1-2]，秦皮的主要化学成分是香豆素[3]。白芷[4]、北沙参[5]等植物中都含有香豆素类成分，其多以糖类化合物的形式存在于植物器官中，如花、嫩叶、果实等，此外，在某些真菌中也发现有香豆素类成分存在[6]。香豆素类成分的生物活性极高，现代医学已经证实香豆素类成分对于多种人类顽疾[7]具有治疗功效，且存在进一步的研究价值。医学上发现香豆素对肿瘤、过敏、发炎具有一定的治疗效果[8-13]，香豆素还是一种天然抗氧化剂[14]，可延缓人体的衰老，增强自身抵抗力。大量研究从生物化学分子构成上阐述了天然香豆素的药理功效，天然香豆素的母核不同位置的不同取代基对于其生物活性的影响起决定性作用[15]。秦皮甲素属于香豆素类化合物，因此本文以秦皮甲素标准品[16]来研究提取总香豆素的含量。借助超声波辅助法提取秦皮中香豆素，并对提取物进行抗氧化性研究，以期为秦皮中香豆素的提取、开发以及综合利用提供理论参考和试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

秦皮，购自药材店，符合《中华人民共和国药典》规定，无水乙醇（分析纯，质量分数≥99.7%）；秦皮甲素对照品（分析标准级，质量分数≥98%），酷尔生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

FW100 型高速万能粉碎机、WGLL-230BE 型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；BSA2245-CW型电子天平，维多利斯科学仪器（北京）公司；JP-010型数控超声波清洗器，深圳市洁盟清洗设备有限公司；722G 型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；LC-2030 型液相色谱仪，岛津企业管理有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理

精确称取秦皮粉末1.00 g，将其置于烧杯中，将乙醇作为提取溶剂，固定超声功率100 W；超声温度50 ℃；超声时间50 min；提取次数为3 次，用200 目纱筛进行过滤，将滤液趁热减压抽滤，最后用乙醇定容于100 mL 容量瓶中，测定香豆素的含量并计算得率。

1.2.2 单因素试验设计

1.2.2.1 表面活性剂用量的筛选

分别加入质量分数为0、1%（0.01 g）、3%（0.03 g）、5%（0.05g）、7%（0.07g）的表面活性剂十二烷基硫酸钠，按“1.2.1”中的条件提取，研究不同表面活性剂用量对秦皮香豆素得率的影响。

1.2.2.2 乙醇浓度的筛选

加入的乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%，按“1.2.1”中的条件提取，研究不同乙醇浓度对秦皮香豆素得率的影响。

1.2.2.3 提取温度的筛选

分别设定提取温度为30、40、50、60、70 ℃，按“1.2.1”中的条件提取，研究不同提取温度对秦皮香豆素得率的影响。

1.2.2.4 提取时间的筛选

分别设定提取时间为20、30、40、50、60 min，按“1.2.1”中的条件提取，研究不同提取时间对秦皮香豆素得率的影响。

1.2.2.5 料液比的筛选

用60%乙醇进行提取，设置料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），按“1.2.1”中的条件提取，研究不同料液比对秦皮香豆素得率的影响。

1.2.3 正交试验设计

以提取时间、提取温度、溶剂浓度、料液比为主要影响因素，以香豆素得率为考察指标，进行L9(34)正交试验，试验因素与水平见表1。

表1 L9(34)正交试验因素水平表Table 1 L9(34)orthogonal test factors and levels table

1.2.4 香豆素得率的测定

用电子天平称取秦皮甲素标准品8 mg，用无水乙醇溶解定容至100 mL 的容量瓶中，制备成质量浓度为0.08 mg/mL 的标准品溶液，然后分别量取2.5、5、7.5、10、12.5、15 mL，用无水乙醇定容到50 mL 的容量瓶中，摇匀后静置，配制成标准溶液。

色谱条件：C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为0.1%甲酸溶液∶甲醇＝1∶9 进行洗脱，检测波长：334nm，进样量：10 μL，柱温：30 ℃，流速：0.6 mL/min，保留时间约为3 min，测定香豆素色谱峰面积。绘制标准曲线，得到峰面积（Y）与香豆素质量浓度X（μg/mL）的标准曲线回归方程为Y＝39 564.45 X-19 828.13，其中R2＝0.999 53。按照香豆素标准曲线的测定方法测定样品色谱峰面积，按下式计算香豆素得率。

式中：c 为香豆素标准曲线计算出的提取液浓度（mg/mL）；v 为样品溶液体积（mL）；n 为稀释倍数；m为秦皮粉末质量（mg）。

1.2.5 抗氧化性试验

1.2.5.1 DPPH 自由基清除率的测定

参照谢佳函等[17]的方法，稍作修改。精密称取DPPH 2.5 mg，用无水乙醇定容到100 mL 容量瓶中，取7支10mL 具塞试管，分别量取1、1.5、2、2.5、3、3.5、4mL 浓度为1.897 mg/mL 的香豆素提取液，分别加入2 mL 的DPPH 溶液（现配现用，避光放置），摇匀后静置30 min，用可见分光光度计测量吸光度值为A，波长调至517nm，以无水乙醇加DPPH 溶液为空白对照，记为A0；待测样品和无水乙醇加DPPH 溶液的混合液为空白，记为B。空白对照中DPPH 的浓度与加入不同体积的香豆素提取液的浓度一致。VC 作为对照组。按下式计算清除率。

1.2.5.2 羟自由基清除率的测定

参照薛天乐[18]的方法，稍作修改。取7 支20 mL具塞试管依次加入0.5 mL 浓度为9 mmol/L 的水杨酸-乙醇溶液，分别量取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL浓度为1.897 mg/mL 的香豆素提取液于试管中，加入0.5 mL 浓度为9 mmol/L 的硫酸亚铁溶液、3.5 mL 蒸馏水，最后再加入5.0 mL 浓度为88 mmol/L 的双氧水，摇匀，静置15 min。待溶液反应完全，于510 nm 处测定吸光度A，参比为蒸馏水。用0.5 mL 的蒸馏水代替双氧水溶液测得的吸光度为B，参比为蒸馏水。用0.5 mL 的蒸馏水代替秦皮中香豆素提取液所测得的吸光度为A0，参比为蒸馏水。空白对照中DPPH 的浓度与加入不同体积的香豆素提取液浓度一致。VC 作为对照组。按“1.2.5.1”中公式计算清除率。

1.2.6 数据处理

使用Origin 8.0 软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 香豆素提取单因素试验结果

2.1.1 表面活性剂用量对秦皮香豆素得率的影响

由图1 可知，随表面活性剂的增加，秦皮中香豆素得率呈先上升后下降的趋势。当表面活性剂的质量分数为3%时，得率达到最大，这可能是因为表面活性剂所特有的双亲分子结构在香豆素提取过程中使表面张力降低，更容易让乙醇渗入到香豆素中，内扩散速度加快。综上考虑，表面活性剂质量分数为3%较为适宜。

图1 表面活性剂用量对秦皮香豆素得率的影响Fig.1 Effects of surfactants additions on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.1.2 乙醇浓度对秦皮香豆素得率的影响

由图2 可知，随着乙醇浓度的增大，得率呈现出先上升后下降的趋势。当乙醇浓度达到60%时，香豆素得率达到最高点，这可能是因为60%乙醇浓度的极性与香豆素的极性非常接近。所以，选择60%的乙醇浓度较为适宜。

图2 乙醇浓度对秦皮香豆素得率的影响Fig.2 Effects of ethanol concentrations on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.1.3 提取温度对秦皮香豆素得率的影响

由图3 可知，随着温度升高，得率先上升后下降，当温度达到50 ℃时，得率达到最高点，而超过50 ℃开始下降。可能是因为温度过高，当接近或达到沸点时，乙醇挥发变快，浸出过程难以稳定，从而造成得率降低。另外，高温条件下可能有更多的杂质溶出，因此综合考虑，选取50 ℃为较适宜的提取温度。

图3 提取温度对秦皮香豆素得率的影响Fig.3 Effects of extraction temperatures on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.1.4 提取时间对秦皮香豆素得率的影响

由图4 可知，随着提取时间的延长，得率先上升后下降，提取时间为50 min 时得率最高，之后得率下降，这可能是因为超声波具有机械剪切作用，长时间作用破坏了香豆素的结构，使得后续处理过程中秦皮香豆素损失而影响得率。因此，选择提取时间为50 min 较为适宜。

图4 提取时间对秦皮香豆素得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.1.5 料液比对秦皮香豆素得率的影响

由图5 可知，在料液比（g/mL）为1∶5～1∶10 范围内，秦皮香豆素得率呈上升趋势，这可能是因为当秦皮质量一定时，溶剂用量越大，它的体系渗透压就越大，香豆素越容易提取出来。但继续增大溶剂用量，得率趋于下降，这是因为当提取溶剂用量增大到一定程度后，随着提取的进行，渗透压变化减小，渗透压的改变对香豆素提取不再有明显的作用，当溶剂用量过大时，增加了超声波破碎细胞的阻力，使细胞破碎程度开始下降，故降低了有效成分的提取。因此，综合考虑，选取料液比1∶10（g/mL）较为适宜。

图5 料液比对秦皮香豆素得率的影响Fig.5 Effects of material-liquid ratios on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.2 正交试验结果

由表2 可知，秦皮中香豆素提取的最佳工艺条件为A2B1C1D2，即提取时间40 min、提取温度60 ℃、乙醇浓度50%、料液比为1∶10（g/mL）。按此条件进行3次验证试验，取平均值，得到秦皮中香豆素得率为1.038%。由表3 可知，4 种因素对得率的影响均不显著。

表2 超声辅助提取秦皮香豆素L9(34)正交试验结果Table 2 L9(34)orthogonal test results of ultrasonic-assisted extraction of coumarin from cortex fraxini

表3 方差分析结果Table 3 Results of variance analysis

2.3 香豆素抗氧化性研究结果

2.3.1 香豆素提取液对DPPH 自由基的清除能力

由图6 可知，香豆素提取液对DPPH 自由基有较好的清除能力，随着浓度的升高清除能力逐渐增强，且显著高于对照组VC 的清除率（P＜0.05），当溶液体积为3 mL 以后清除作用逐渐平稳。香豆素提取液和VC 对DPPH 自由基都具有良好的清除能力，表明香豆素具有很好的抗氧化作用，相同浓度下对DPPH 自由基的清除能力强于VC。

图6 香豆素提取液和VC 对DPPH 自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effects of coumarin extract and VC on DPPH free radicals

2.3.2 香豆素提取液对羟自由基的清除能力

由图7 可知，香豆素提取液对羟自由基具有很强的清除能力，并且随着样品浓度升高其对羟自由基的清除作用加强。当溶液体积增至2.5 mL 以后，VC 清除率趋于稳定，香豆素提取液在3 mL 以后清除率趋于平稳，且在相同浓度下，样品溶液羟自由基清除能力均显著高于VC 溶液（P＜0.05），说明香豆素提取液抗氧化活性高于VC 溶液。

图7 香豆素提取液和VC 对羟自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of coumarin extract and VC on hydroxyl radicals

3 结论

本文采用表面活性剂强化技术，通过超声波辅助提取秦皮中香豆素，在单因素试验基础上，以正交试验优化了提取工艺。得到秦皮中香豆素的最佳提取工艺条件为：表面活性剂用量3%，提取时间40 min，提取温度60 ℃，乙醇浓度50%，料液比1∶10（g/mL），平均得率为1.038%。抗氧化试验结果表明，秦皮中香豆素具有很好的抗氧化作用，相同浓度下样品溶液对DPPH 自由基和羟自由基的清除能力强于VC。

本文选取十二烷基硫酸钠作为表面活性剂，对秦皮香豆素提取有强化作用，且成本较低，具有较好的发展前景，可为香豆素的提取以及秦皮的开发提供积极的参考价值。