鄢树枫 ，吴珊涛 ，黄晓晨 ，邢建宏 ，张君诚

（1.三明学院 资源与化工学院，福建 三明365004；2.中国科学院福建物质结构研究所，福建 福州 350002）

当前，新型冠状病毒肺炎、癌症和心脑血管疾病等仍然在全世界范围内严重威胁人类健康。截止2021年3月，全球新型冠状病毒肺炎感染者已超2 600万例，累计死亡病例约280万例。癌症则是严重危害人类健康的重大疾病之一，每年均造成大量患者死亡[1-3]。科技和生活水平的提高促使研究人员更加关注人类健康问题。为提高病毒、癌症等各类疾病的治疗效果，科研工作者致力于探索实用高效的药物和药物载体。纳米药作为新型药物的杰出代表已被广泛报道和应用，在病毒防治、肿瘤诊疗等方面展现巨大的应用潜力和前景[4-6]。在众多纳米药物载体中，聚多巴胺（PDA）化学性质稳定，具有较好的生物相容性和分散性等优点，已普遍应用于生物医药、能源开发等领域。PDA作为一种极具潜力的药物载体，其表面丰富的基团能结合并负载多种药物分子[7-8]。叶酸（FA）因其与叶酸受体的高亲和力，使之成为一种高效的肿瘤细胞靶向配体，能够靶向多种高表达叶酸受体的人类肿瘤细胞，例如乳腺癌、肺癌、宫颈癌等[9]。本研究基于盐酸多巴胺的自聚反应[10]，将其与叶酸分子共聚获得聚多巴胺-叶酸(PF)纳米颗粒，研究其物理化学性质、分散性和稳定性；在此基础上，分析PF纳米颗粒对抗病毒药物磷酸氯喹和抗肿瘤药物酞菁锌光敏剂的载药性能，并通过细胞实验研究小鼠乳腺癌肿瘤细胞对PF纳米颗粒的摄取情况，从而评价其潜在的生物医药应用前景，以期为病毒防治、肿瘤治疗等提供新型药物载体。

1 材料与方法

1.1 材料

实验相关化学试剂主要购买于阿尔法化工有限公司、西格玛奥德里公司等。实验所用的细胞耗材和试剂购买于上海碧云天生物科技有限公司。小鼠乳腺癌细胞4T1由中国科学院福建物质结构研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 PF纳米颗粒的合成及表征

合成PF纳米颗粒的反应溶剂体系为：2 mL氨水（28%～30%），24 mL无水乙醇和50 mL超纯水。首先，将以上体系混合，室温条件下匀速搅拌30 min，加入叶酸500 mg，充分溶解。称取300 mg盐酸多巴胺粉末溶解于3 mL超纯水中，快速加入反应体系，持续搅拌约24 h。观察反应体系的颜色变化可初步判断盐酸多巴胺聚合情况，反应体系颜色从无色转变成棕色，至收样时颜色呈黑色。将混合体系离心，用超纯水反复洗涤5～8次，至洗涤液上清无色，沉淀即为PF纳米颗粒。进行系列表征，动态光散射仪（Zetasizer Nano ZS 3600，Malvern Instruments）检测PF纳米颗粒在生理盐水溶液中的粒径大小和Zeta电位；利用扫描电镜（JSM 6700F，JEOL Instruments）观察PF纳米颗粒的表面形态和大小等。

1.2.2 PF纳米颗粒的分散性及稳定性研究

PF纳米颗粒的分散性及稳定性对其生物医学应用效果有突出的影响作用。为测定PF纳米颗粒的分散性和稳定性，将制备好的PF纳米颗粒定量称取5 mg，置于生理盐水溶液中，观察其在生理盐水溶液中的分散效果。在此基础上，于不同时间点0、24和48 h，分别观测PF纳米颗粒在生理盐水溶液中的沉降速率，拍照对比，分析其在生理盐水溶液中的稳定性能。

1.2.3 PF纳米颗粒的载药性能研究

为测定PF纳米颗粒的载药性能，本研究选用抗病毒药物磷酸氯喹（chloroquine phosphate,CP）和抗肿瘤药物酞菁锌光敏剂（ZnPc）来测定PF纳米颗粒的载药性能。首先合成足量PF纳米颗粒，将制备的PF纳米颗粒分散于生理盐水溶液中，分别加入制备好的磷酸氯喹和酞菁锌光敏剂溶液，置于搅拌机上搅拌4 h促使药物充分负载。将以上反应体系溶液离心，用生理盐水溶液反复洗涤5-8次，至洗涤液上清无颜色，收取的沉淀即分别为PF-CP和PF-ZnPc。将PF-CP和PF-ZnPc进行紫外吸收光谱分析，使用酶标仪（Synergy 4，BioTek Instruments）分别测定纳米复合药物上磷酸氯喹和酞菁锌光敏剂的特殊紫外吸收峰值，从而获得PF纳米颗粒对磷酸氯喹和酞菁锌光敏剂的负载量。

1.2.4 PF纳米颗粒的细胞摄取实验研究

取冻存于液氮中的小鼠乳腺癌4T1细胞，复苏后传代培养，约2～3代后的细胞在显微镜下观察细胞状态并计数。贴壁细胞应铺满80%以上T-25细胞培养瓶底部，满足本次实验所需细胞数目。用胰酶消化处理贴壁细胞，根据细胞计数结果，加入足量新鲜的细胞培养基稀释细胞悬液至细胞实验浓度为50 000个/mL，吹打均匀后将细胞均匀转移至96孔细胞培养板中，每孔200 μL，保证细胞悬液的终浓度为10 000个细胞/孔，将细胞置于37℃、CO2培养箱中过夜培养。每组设置3个复孔以减小实验误差。将小鼠乳腺癌4T1细胞与足量PF纳米颗粒共孵育，在不同的时间点（0.5、1、2和4 h）检测4T1细胞对PF纳米颗粒的药物摄取量。具体实验步骤如下：在不同检测时间，将细胞培养基吸出，用生理盐水洗涤细胞表面3次后，加入200 μL细胞裂解液（0.1 mol/L NaOH/l%SDS（十二烷基硫酸钠））处理1 h，促使细胞充分裂解成均一溶液。在酶标仪中测定各样品空细胞提取液的荧光值，测定各样品孔细胞的总蛋白量。分别取各孔裂解液20 μL于96孔透明板中，每孔分别加入200 μL BCA（bicinchoninic acid）工作液，室温中放置2 h，检测562 nm处紫外/可见吸收值。根据牛血清白蛋白标准曲线，计算实验孔细胞的总蛋白量。用每毫克蛋白含有的PF纳米颗粒的量评价细胞对PF纳米颗粒的摄取情况。

2 实验结果与讨论

2.1 PF纳米颗粒的物理化学性能分析

用于生物医药应用的纳米颗粒应具有较优的物理化学性能[11]。通过研究PF纳米颗粒的粒径、表面电位和表观形态对其物理化学性能进行分析。如图1所示，PF纳米颗粒的粒径约为160 nm，粒径分布均匀。PF纳米颗粒的尺寸受诸多因素影响，包括溶剂成分、酸碱度、多巴胺浓度和搅拌速率等。PF纳米颗粒需在碱性条件下合成，但碱性条件易加快纳米颗粒的合成速率，导致颗粒深度聚集，PF纳米颗粒尺寸增大，从而降低其生物可利用率。因此，严格控制整个合成过程的条件，包括试剂纯度、浓度、反应温度和搅拌速率等，从而制备获得约160 nm的PF纳米颗粒。从图1 PDA和PF纳米颗粒的表面电位测量结果可知，叶酸分子与聚多巴胺分子能够稳定聚合成复合PF纳米颗粒。扫描电镜结果（图2）所示，PF纳米颗粒为圆球形颗粒，颗粒粒径约160 nm，颗粒尺寸大小均匀稳定，为PF纳米颗粒的生物医药应用奠定基础。有研究表明，纳米颗粒的大小能够显著影响细胞对外来药物的摄取量，细胞对于200 nm大小以内的颗粒具有比较好的摄取能力[12]。本实验合成的160 nm的纳米颗粒有利于细胞对其进行摄取，保证了其作为药物载体能够稳定地将药物运送至细胞内，从而提高药物的生物利用率和有效性。

图1 PF纳米颗粒的粒径（左）及Zeta电位（右）

图2 PF纳米颗粒的扫描电镜图

2.2 PF纳米颗粒在生理盐水溶液中的分散性

具有生物医药应用价值的纳米颗粒应具有优良的分散性能[13]。通过对PF纳米颗粒在生理盐水中的分散性进行研究，有助于了解其生物医学应用前景。PF纳米颗粒高浓度时呈现黑色，低浓度时呈现浅褐色。由此可通过观察其在澄清生理盐水溶液中的颜色分布，从而判断其分散性。由颗粒分散性结果（图3）可知，黑褐色的PF纳米颗粒较为均匀地分布于溶剂体系中，说明PF纳米颗粒在生理盐水溶液中具有较好的分散性。保持试剂瓶固定不动，分别在24和48 h后多次观察PF纳米颗粒在生理盐水中的分散程度。由图可见，PF纳米颗粒在生理盐水中静置约24和48 h后，仍然保持较好的分散效果，颗粒沉降率低，证明PF纳米颗粒能够在生理状态下稳定存在超过48 h。PF纳米颗粒在生理盐水溶液中的良好分散性是其成为高效药物载体的前提。临床应用纳米颗粒药物时，药物负载于纳米颗粒并注射进入体内，有且仅有分散性良好的纳米药物才能够在体液中稳定运输，从而实现高效的靶向药物供应作用。由此可见，PF纳米颗粒具有成为高效药物载体的应用潜力。

图3 PF纳米颗粒的分散性与稳定性（生理盐水）

2.3 PF纳米颗粒的载药性能

对PF纳米颗粒的载药性能进行研究有助于了解其作为药物载体的应用潜力和前景[14]。分别将抗病毒药物磷酸氯喹（CP）和抗肿瘤药物酞菁锌光敏剂（ZnPc）负载于PF纳米颗粒。通过检测磷酸氯喹和酞菁锌光敏剂的特殊紫外可见吸收值，计算PF纳米颗粒对两种药物的负载量。结果如图4所示，PF纳米颗粒的磷酸氯喹负载量约为2.6%，酞菁锌光敏剂的负载量约为4.9%。证明PF纳米颗粒对抗病毒药物磷酸氯喹和抗肿瘤药物酞菁锌光敏剂都具有较好的负载能力。鉴于PF纳米颗粒在生理盐水中具有良好的分散性，利用其负载水溶性较低的药物，能够提高此类药物在机体内的给药量和稳定性。当前纳米药物载体在临床应用中普遍存在负载率低的瓶颈问题，急需开发高效的纳米药物载体。PF纳米颗粒的载药性能研究结果证明其满足纳米药物载体的负载量要求，具有负载多种药物的作用，从而提高药物的靶向供应量。

图4 PF纳米颗粒对磷酸氯喹CP和酞菁锌光敏剂ZnPc的负载量

2.3 小鼠乳腺癌4T1细胞对PF纳米颗粒的摄取分析

研究细胞对PF纳米颗粒的药物摄取量有助于了解PF纳米颗粒作为药物载体进行细胞给药的能力。选用小鼠乳腺癌4T1细胞，加入足量的PF纳米颗粒，研究其在0.5、1、2和4 h的摄取时间下对PF纳米颗粒的摄取量，以每毫克蛋白含有的PF纳米颗粒量（nmol/mg）评价细胞对PF纳米颗粒的摄取情况。结果如图5所示：小鼠乳腺癌4T1细胞对PF纳米颗粒的摄取量与药物处理时间呈正相关。小鼠乳腺癌4T1细胞在0.5～2 h能够快速摄取PF纳米颗粒，在2 h后虽仍有摄取，但摄取量趋于平衡，达到摄取平台期。实验结果证明PF纳米颗粒能够快速被小鼠乳腺癌4T1细胞摄取，将其作为药物载体，有利于药物快速进入肿瘤细胞内，从而快速实现药物的药理活性。前文已证明本实验合成的PF纳米颗粒的尺寸大小符合细胞最佳摄取要求，并且能够高效负载多种药物。在此前提下，肿瘤细胞对PF纳米颗粒的高效快速摄取效应进一步保证了药物的供应量，从而在负载量和摄取量两方面共同促进药物的治疗作用。

4 结论

本研究合成形态稳定、尺寸均匀的PF纳米颗粒，证明其在生理盐水中具有良好的分散性和稳定性。通过抗病毒药物磷酸氯喹和抗肿瘤药物酞菁锌光敏剂的负载研究，证明PF纳米颗粒具有良好的药物负载能力。同时，细胞摄取实验结果证明PF纳米颗粒能够被小鼠乳腺癌4T1细胞稳定、快速摄取，有助于将其作为药物载体进行高效的细胞给药。本课题合成的PF纳米颗粒具有良好的应用前景，对临床所用药物的高效负载和运输具有一定的参考价值。