杨 琳 ，张杭颖 ，陈 月 ，范静秀 ，杨 帆 ，张君诚

(1.三明学院 资源与化工学院，药用植物开发利用福建省高校工程研究中心,福建 三明,365000;2福建农林大学 食品科学学院,福建 福州,350000)

金线莲(Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.)是华南地区重要特色中草药，有“药王”、“金草”美誉，长期受市场追捧，被列入福建省首批种业创新与产业化工程支持项目。其具有抗氧、抗病毒和抗癌的功效，可有效清除体内的氧自由基，阻止细胞的退化、衰老，参与人体免疫调节，对提高人体免疫力，对肝、肾、肺等器官的慢性病康复和疗养具有一定作用，福建中医药管理局也将其列为抗新冠病毒中药的储备品种[1-5]。国家卫健委鉴于食用传统已允许地方制定金线莲食品安全地方标准。但长期的过渡采摘和生态破坏使金线莲的野生资源锐减，组织培养和林下栽培技术被广泛运用于金线莲培育[6-8]。但不同来源的金线莲主要活性成分存在差异，主要成分安全与食用价值问题困扰着金线莲产业的发展。

金线莲含有多种氨基酸、黄酮、多糖、生物碱、挥发油、甾醇等多种活性成分[8]，具有抗炎、抗氧化、免疫调节和降血糖等功效[1-5]。研究表明不同来源的金线莲成分含量不尽相同。使用HPLC法检测52批金线莲样品中12个核苷类成分含量，结果表明腺苷、尿苷、鸟苷、胞苷含量较高 (均值大于300 μg·g-1)，不同来源金线莲核苷成分具有4类化学表型，含量之间存在差异[9]。郑丽红等分析了野生(来自福建南靖)、种植(组培4个月，种植3个月)和组织培养(组培4个月)三种金线莲药材中核苷类物质，发现在这三种金线莲药材中具有多种相同成分，就核苷及碱基类成分的总含量而言，组培最高(2.201 3 mg/g)，种植其次(1.856 8 mg/g)、野生最低(1.663 9 mg/g)[10]。野生来源的金线莲与组培金线莲中微量元素的含量有较大差异，但水分和灰分含量的差别不大[11]。组织培养不同来源的金线莲含水率差异较小，醇溶性浸出物成分差异显著，且醇溶性浸出物含量与总黄酮含量呈正相关，含水率、多糖含量与醇溶性浸出物、总黄酮呈负相关[12]。另外，张藏蔓等建立野生、组织培养和种植不同来源金线莲的HPLC指纹图谱，并比较不同来源金线莲及其近缘植物整体的差异，为完善金线莲药材的质量标准提供实验依据[13]。对不同基原金线莲植物的化学成分比较结果表明，福建金线莲组培植株、台湾金线莲组培植株和福建金线莲林下种植植株化学成分组成及含量非常相似[14]。对云南省3个主要金线莲栽培品种的活性成分比较分析发现，滇越金线兰总黄酮和氨基酸总量显著高于2个福建品种[15]。栽培金线莲生物量及活性成分随着移栽时间延长总多酚及总黄酮含量缓慢增长，总多酚和总黄酮在种植满150 d达到最大值，而多糖含量则递减[16]。在已报道的文献中，有对组织培养、林下种植和野生金线莲核苷类物质、微量元素、多糖和总黄酮等含量的比较分析。但组织培养、林下种植和野生金线莲的来源品系各不相同，其活性成分的含量差异并不能为产品替代提供直接依据。

本文分别采用了超声波辅助提取－紫外分光光度计法、食品中氨基酸的测定方法(GB/T 5009.1242016)和碱性酒石酸铜滴定法，检测野生(采自福建德化地区的尖叶金线莲，叶卵圆形，叶片墨绿，叶脉金色，经三明学院张君诚教授鉴定为兰科开唇兰属植物金线莲，以下简称野生)、组织培养(以福建德化的尖叶金线莲为外植体，组织培养4个月，以下简称组培)和林下种植(以福建德化的尖叶金线莲为外植体，组织培养4个月后移栽至林下种植10个月，以下简称种植)三种同一品系不同来源金线莲中的总黄酮、氨基酸及多糖含量，比较分析三种不同来源金线莲的主要活性成分的差异，综合评价不同来源金线莲的药用价值，探讨人工栽培金线莲替代野生金线莲的可行性，为产品质量提升和产品市场扩充提供参考。

1 材料与方法

1.1 三种来源金线莲样品制备

野生金线莲采自福建德化地区的尖叶金线莲，叶卵圆形，叶片墨绿，叶脉金色，经三明学院张君诚教授鉴定。组织培养金线莲以福建德化的尖叶金线莲为外植体，组织培养4个月后长成完整植株。林下种植金线莲是取组织培养4个月后长成完整植株的金线莲，移栽至阔叶林林下种植10个月。

1.2 总黄酮的提取和检测

取长势一致的野生、组培和种植金线莲全株，洗净、使用真空干燥箱6050（深圳市艾斯科仪器设备有限公司）55℃烘干至恒重，再使用食物处理器MR9401（广东新宝电器股份有限公司）粉碎植物样品，用95%的乙醇定容至25 mL，采用超声波辅助提取－紫外分光光度计法，参照姚欢欢等使用的《保健食品检验与评价技术规范（2003年版）》中的实验方法[17]，设置三次生物学重复，三次技术重复，取平均值。

1.3 氨基酸的提取和检测

取长势一致的野生、组培和种植金线莲全株，洗净晾干后，参照刘伟等使用的GB/T 5009.124－2016《食品中氨基酸的测定》中的实验方法[18]，用手持式高速匀浆机CS-10（上海测博，上海）打成匀浆，最后用氨基酸自动分析仪测定氨基酸的含量，设置三次生物学重复，三次技术重复，取平均值。

1.4 多糖的提取和检测

取长势一致的野生、组培和种植金线莲全株，参照朱旭伟等使用的《保健食品功效成分检测方法（2002年版）》中的碱性酒石酸铜滴定法[19]，测定金线莲中多糖含量，设置三次生物学重复，三次技术重复，取平均值。

2 结果与分析

2.1 总黄酮含量比较

三种不同来源金线莲中总黄酮含量的结果显示：组培来源的金线莲总黄酮含量为0.28 g/100g，种植金线莲和野生金线莲总黄酮含量均为0.30 g/100g，但三者差异不显著，结果见图1。黄酮广泛存在于自然界的某些植物和浆果中，总数大约有4千多种。它是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生。金线莲中，黄酮含量的高低是评价其药用价值的重要指标。由实验结果可知，组培、种植和野生金线莲尽管来源不同，生长时间存在差异，但总黄酮含量并不存在明显差异。有研究显示，野生金线莲总黄酮含量(1.434%)高于组织培养来源的金线莲(0.916%)，两者之间呈现显著水平差异[20]；种植金线莲(组织培养5个月移栽林下种植6个月)中五种黄酮类化合物的总含量(2.911 mg/g)是组培金线莲的4倍(0.706 mg/g)[21]；移栽3月龄以上的金线莲总黄酮含量高于组织培养的金线莲[22]。但也有研究表明，台湾种源的组培金线莲总黄酮含量(7.62 mg/g)略高于台湾种源(6.06 mg/g)、云南种源(7.09 mg/g)和广西种源(5.34 mg/g)的野生金线莲总黄酮含量[23]。因此，野生、种植和组培金线莲总黄酮含量与外植体的来源、生长时间等因素密切相关。

图1 三种不同来源金线莲的总黄酮含量

2.2 氨基酸含量比较

野生金线莲、组培金线莲和种植金线莲中16种氨基酸的总含量分别为1.60、0.58、1.13 g/100g。野生金线莲16种氨基酸的总含量分别是组培和种植金线莲的2.76倍和1.42倍(图2，表1)。三种不同来源金线莲的氨基酸均以天冬氨酸为主，其含量占16种氨基酸总含量的36.88%(野外)、17.24%(组培)、22.12%(种植)。谷氨酸和亮氨酸的含量分居第二、第三位。蛋氨酸含量在检测的16种氨基酸中含量最低，在组培金线莲中的含量低至无法检测。组培金线莲16种氨基酸含量均小于种植和野生金线莲。种植金线莲的苏氨酸、亮氨酸和脯氨酸的氨基酸含量与野生金线莲组相等，天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸含量分别少于野生金线莲0.24、0.02 g/100g，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨酸含量比野生金线莲少0.01 g/100g(表1)。由此可知，野生金线莲16种氨基酸含量均高于种植和组培金线莲，且差异显著。其它研究表明，种原地为福建、广东、浙江、江西和贵州的组培金线莲总氨基酸量为11.38%～17.06%，其中天门冬氨酸、谷氨酸和精氨酸的含量明显高于其他氨基酸组分[24]。金线莲各氨基酸含量以天冬氨酸最高，蛋氨酸含量最低，组培和野生来源的金线莲游离氨基酸含量范围为1.91%～7.92%，且组培金线莲游离氨基酸含量较高，培养基种的6-AB含量会影响游离氨基酸富集[25]。

图2 不同来源金线莲中总氨基酸含量

表1 三种不同来源金线莲中主要氨基酸含量对比表

人体必需氨基酸是指人体不能通过自己合成来满足人体需要，必需通过食物获得的氨基酸，包括：苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和色氨酸。三种不同来源金线莲中，除组培来源的金线莲未测到蛋氨酸含量外，其他人体必需氨基酸均在三种来源的金线莲中被检测到(表1,图3)。图3线段围成的面积表示不同来源金线莲中部分成人必需氨基酸的总和，分别为0.45 g/100g(野生)、0.4 g/100g(林下)、0.22 g/100g(组培)。亮氨酸在人体必需氨基酸中含量最高，在野外、组培和种植金线莲中的含量分别为0.10、0.06和0.10 g/100g。三种不同来源的金线莲中人体必需氨基酸总量占16种氨基酸总量的比例分别为28.13%(野生)、37.93%(组培)、35.40%(种植)。有研究表明，不同种源地的组培金线莲必需氨基酸为2.81%～4.47%，丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸为金线莲的特征性氨基酸[24]。

图3 三种不同来源金线莲中部分成人必需氨基酸的含量对比图

婴儿必需氨基酸除了人体必需的氨基酸外，还包括精氨酸，早产儿必需氨基酸还包含精氨酸和酪氨酸。有研究显示，左旋精氨酸和组氨酸有增强心脏停博液的效果，对婴儿及早产儿心肌具有保护作用[26]，精氨酸对新生儿坏死性小肠结肠炎和胎儿宫内生长受限等有一定预防作用[27]。三种不同来源的金线莲中，婴儿及早产儿必需氨基酸的含量如表1和图4所示，占16种氨基酸总含量的比例中，种植金线莲最高(45.13%)，组培金线莲次之(44.83%)，野生金线莲最低(36.88%)。

图4 三种不同来源金线莲中婴儿及早产儿的必需氨基酸的含量对比图

综上，虽然野生金线莲的总氨基酸含量高于组培和种植金线莲，但是其成人必需氨基酸、婴儿必需氨基酸含量占比都低于组培和种植金线莲。组培和种植金线莲中成人必需氨基酸和婴儿必需氨基酸占16种总氨基酸的比例相近，但组培金线莲生长周期(4个月)较种植金线莲(14个月)短。

2.3 多糖含量比较

金线莲多糖具有免疫调节、抗病毒、抗癌和降血糖等多种功能。通过碱性酒石酸铜滴定法检测，组培、种植和野生来源的金线莲多糖含量分别为1.00、1.70、0.60 g/100g(图5)。种植金线莲多糖含量高于组培和野生金线莲，分别是它们的1.70倍和2.83倍。组培金线莲生长周期(4个月)比种植金线莲周期(14个月)短，比野生金线莲获取方便，且多糖含量高。有文献报道，组织培养和野生来源的金线莲多糖含量变化范围在7.50%～15.31%，组织培养金线莲的多糖含量高于野生来源的金线莲[27]。金阔叶林林下栽培苗金线莲的多糖含量高于繁殖瓶苗和大棚栽培苗，其中林下栽培3个月的多糖含量最高[28]。对组培和种植金线莲多糖含量的动态检测结果表明，它们的变化均呈“双峰”曲线式增长[29]。另外，不同栽培时间金线莲各组织的多糖含量也存在差异，处于蕾期、花期的金线莲，其根部的多糖含量最高，其他时期则以茎、叶的多糖含量高[28]。据此，组培和种植来源的金线莲多糖含量与生长时间、海拔、取样组织、提取检测方法等因素相关。

图5 三种来源金线莲中多糖含量的比较分析

3 结论

种植金线莲与野生金线莲的总黄酮含量大体相同，均为0.30 g/100g，组培来源的金线莲中总黄酮含量(0.28 g/100g)最低，但三者差异不显著。三种来源的金线莲中天冬氨酸含量最高，谷氨酸次之，蛋氨酸最低。组培金线莲16种主要氨基酸的含量均小于种植金线莲，种植金线莲部分氨基酸含量和总氨基酸含量小于野生金线莲。种植金线莲多糖含量(1.70 g/100g)高于组培来源的金线莲(1.00 g/100g)和野生来源的金线莲(0.60 g/100g)。综上，不同来源的金线莲含有黄酮、氨基酸和多糖的比例不同。野生金线莲在市场中的价格较高，但总黄酮含量与组培和种植金线莲差异并不显著，多糖含量甚至低于组培和种植金线莲。其总氨基酸含量虽然比种植和金线莲高，但人体必需氨基酸和婴幼儿必需氨基酸的所占比例比组培和种植的金线莲低。三种来源金线莲中，林下种植金线莲的总黄酮、氨基酸和多糖含量与野生金线莲相近，可作为三种有效成分提取利用的有利原料。

作者贡献：

杨琳是本研究的实验设计和实验研究的执行人，陈月、范静秀完成资料整理及论文初稿的写作；张杭颖、杨帆参与实验设计和试验结果分析，张君诚是项目的构思者及负责人，指导实验设计、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。