左娜颖 张远达 董青伟 张思思 宋浩彬

诺如病毒（Norovirus，NoV）是病毒性急性肠胃炎的主要病原体之一[1]。诺如病毒感染分为有症状的和无症状的，约有30%的诺如病毒感染者无症状[2-3]。尽管症状性感染备受关注，但由于缺乏可用的诺如病毒感染动物模型，因此对症状性诺如病毒感染的原因了解甚少[4-5]。为了开发针对症状预防和预防感染更有效疫苗，需要更清楚地了解症状的潜在免疫学驱动因素。诺如病毒感染导致人体快速免疫反应，感染后24~48 h血清细胞因子升高，且可能与症状同时发生[6]。有研究认为有症状的感染是由免疫介导的损伤或病毒的直接活性引起的，然而病毒载量与症状之间相关联的证据有限[7-8]。本研究通过比较有症状和无症状的个体在诺如病毒感染后血清细胞因子与每日病毒RNA滴度之间的变化，评估症状是否与免疫反应有关或者与病毒负荷量相关。

1 资料与方法

1.1 一般资料

于2018年5月—2019年3月共收集了在本院就诊的100例疑似感染诺如病毒的患儿，经过确诊感染共40例，其中27例出现症状，13例无症状。所有患儿的监护人均签订知情同意书，本研究同时经医院伦理道德委员会审核通过。

纳入标准：年龄＜14岁；粪便中可检测到诺如病毒RNA的存在；体格正常。有症状感染者满足以下条件之一：（1）仅腹泻；（2）呕吐或者并发其他一种症状（即腹部绞痛、恶心、口腔温度≥37.6℃、肌痛、发冷、疲劳或头痛）。粪便或呕吐样品可检测到诺如病毒RNA但无明显并发症的儿童则为无症状感染者。排除标准：HIV血清学呈阳性；细菌或其他病毒感染呈阳性；肝或肾功能或血液指标异常；患有慢性疾病（即狼疮、癌症、肾脏疾病）或自身免疫学疾病。

1.2 病毒检测方法

粪便和呕吐样品通过实时逆转录-定量聚合酶链反应（realtime quantitative polymerasechain reaction，RT-qPCR）进 行 测 试，其中至少有一个样本通过RT-qPCR检测到诺如病毒RNA阳性，则表明受试者感染诺如病毒。使用修正的Vesikari评分评估感染的严重程度[9]，并计算纳入研究的所有个体的感染程度。

1.3 观察指标

（1）分析患者一般资料；（2）比较两组患儿细胞因子水平；由第三方检测：包括干扰素IFN-α2、IFN-γ、白介素（IL）-1a、IL-1b、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor，TNF）-α和TNF-β。

1.4 统计学处理

用SPSS 20.0软件进行数据整理、筛选与统计分析。计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验。采用Pearson相关分析方法探讨全体研究对象，有症状组及无症状组病毒RNA脱落天数及改良Vesikari评分与患者各细胞因子的相关性；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，计算病毒RNA中位脱落时间，采用Log-rank检验比较有症状组及无症状组的脱落预后的差异。采用0.05检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 有症状与无症状感染者基础临床特征分析

100例患儿中，40例确诊为诺如病毒感染，有27例表现了临床症状，两组改良Vesikari评分差异有统计学意义（P＜0.05），其余指标差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 （续）

表1 有症状与无症状感染者基础临床特征分析

2.2 两组患儿细胞因子水平比较

与无症状组相比，有症状组的IFN-γ、IL-1a、IL-1b、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-β具有较高的表达水平（P＜0.05），见表2。

表2 （续）

表2 两组患儿细胞因子水平比较 （±s）

表2 两组患儿细胞因子水平比较 （±s）

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2.3 细胞因子与病毒RNA脱落时间相关性分析

细胞因子与病毒脱落时间进行相关性分析，总体样本与有症状组、无症状组相关性分析结果一致，有症状组、无症状组细胞因子水平变化均与病毒脱落时间无显著相关性（P＞0.05）。

2.4 细胞因子与改良Vesikari评分相关性分析

相关性分析结果显示，总体样本与有症状组相关性分析结果一致，总体样本及有症状组相关性分析表明，IFN-γ、IL-1b，IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-β、IL-1ra与 改 良Vesikari评分有显著统计学相关性（P＜0.05），其余细胞因子与改良Vesikari评分无显著统计学相关性（P＞0.05），见表3。

表3 （续）

表3 细胞因子与改良Vesikari评分相关性分析结果

2.5 有无症状患者病毒RNA脱落状态及生存分析

两组脱落率，差异无统计学意义（χ2=0.683，P=0.409），症状与病毒RNA脱落情况未见统计学相关，见表4；有症状中位脱落时间为25.00 d，无症状中位脱落时间为22.00 d，曲线未见显著差异性，见图1。

表4 有无症状患者病毒RNA脱落情况分析（KM）

图1 生存曲线

3 讨论

本研究结果表明，与无症状的个体相比，有症状的个体的血清中干扰素及白细胞介素的水平明显更高。虽然已经有研究比较感染个体与未感染的个体对诺如病毒攻击的免疫反应[6]。本研究首次对有症状感染和无症状感染进行了探索，发现在感染期间有症状的个体比无症状的个体具有更高的Th1和某些Th-2细胞因子及IL-8水平。轮状病毒胃肠炎的研究发现，与健康对照和非病毒性腹泻对照相比，血清TNF-α与腹泻发病率显著相关[10-11]。其他病毒感染包括乙型肝炎和登革热病毒，与无症状个体相比，有症状的个体中诱导了不同的促炎细胞因子基因表达[12]。有症状的诺如病毒感染中存在血清细胞因子升高，因此表明在诺如病毒感染中症状可能是免疫介导的。

本次研究还发现IFN-γ、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-β、IL-1ra与改良Vesikari 评分具有相关性，同时与其他有关细胞因子水平研究结果类似[13]。鼠诺如病毒能够抑制1型IFN的产生[14]。在本研究中也未观察到1型IFN-α2的显著升高，表明人诺如病毒可能具有机制。因此，这可能说明由于初始病毒控制不佳而导致病毒滴度高的个体可能对升高的促炎细胞因子有反应，以限制病毒复制。

已有研究结果表明，症状性感染及细胞因子与病毒脱落之间没有显著相关性[15]。本研究中测定了一些CD8+T细胞相关细胞因子（IFN-γ、IL-2、TNF-α）也未发现它们的水平与病毒脱落持续时间之间的任何关联。

诺如病毒感染者的组织学研究和某些动物模型表明诺如病毒感染引起肠粘膜特别是上皮损伤，这种损害可能导致免疫激活[16]。但症状的原因尚不明确，有以下三种可能的假设。首先，症状可能是免疫激活的直接结果，轮状病毒感染已表明血清细胞因子升高与症状性疾病有关，高水平的血清细胞因子和免疫激活可能导致严重的症状，包括呕吐和腹泻[17]。其次，症状可能是生理损伤的结果，可能与更大的病毒载量以及直接的病毒活性有关。最后，症状可能与所有三个中心变量（即病毒载量，损伤和免疫激活）有关，并且可能通过已知的其他因素改变免疫因素，例如遗传学，免疫能力，以前曾接触过类似菌株，生理因素或合并感染。

本研究具有不可避免的局限性，首先，纳入的个体相对较少，限制了统计能力。其次，评估病毒脱落时可能出现测量错误。病毒滴度可能取决于粪便量，例如，高纤维饮食的个体可能比低纤维饮食个体的粪便产量更多，因此可能影响了最终病毒滴度的计算。虽然通过累积脱落来避免这种错误，但是在粪便保留或便秘的情况下，也可能会产生偏差。

综上所述，有症状的个体比无症状的个体具有更高的血清细胞因子水平，且有无症状患者与每日病毒RNA滴度，病毒脱落持续时间或累积脱落时间无显著关系。这些发现表明症状可能部分是由免疫介导的机制驱动的，而不是病毒的载量。