不同基因型杂交水稻根系分布特征及其对水稻耐旱能力的影响

2022-01-05王萌冉王学春黎腊梅赵长坤杨国涛陈永军胡运高

东北师大学报（自然科学版） 2021年4期

王萌冉，秦俭，吴凡，王学春，黎腊梅，胡瑶，赵长坤，陈婷，杨国涛，陈永军，胡运高

(1.西南科技大学水稻研究所，四川绵阳 621010；2.四川省农业科学研究院水稻高粱研究所，四川德阳 618000；3.绵阳市农业科学研究院，四川绵阳 621010)

干旱是影响水稻生长发育的重要因素之一，近20年来，干旱使我国水稻减产近25.4%[1].在过去40多年以来，我国平均每年受干旱影响的土地面积高达2 667万hm2，粮食减产700～800亿kg[2]，干旱是限制水稻生产的一个重要因素[3].

水稻在干旱胁迫下表现为株高下降、萎蔫，叶片卷曲、衰老，气孔关闭、叶片生长减少、干物质降低等[4-7].这些变异在不同水稻品种中[4-5，8-9]存在显著差异，很难根据农艺性状中的某一个来鉴定抗旱水稻品种.根系在植物吸收及转移水分和养分中起重要作用，根长、根数量及根系分布与水稻抗旱性有着显著的相关性[10]；干旱胁迫下，水稻为了改善根系的吸水特性，根系发育强壮.相关的研究[11]表明，深根系水稻能通过吸收深层土壤水分，增强其对干旱胁迫的耐受能力.O’Toole 等[12]的研究表明，典型旱稻品种比普通栽培品种具有更深的根.这种深层生根特性极大提高了旱稻品种对土壤深层水分的吸收能力[13].

研究人员以浅根型品种IR64和深根型品种Kinandang Patong杂交育成的重组自交系IK-RILs为材料，在重组自交系9号染色体上发现了控制深根的基因DRO1；在浅根水稻(IR64)中引入DRO1，可增加水稻的根深，使该水稻在干旱条件下保持了高产性能[14-15].这表明DRO1可以改变水稻的生根方式，使水稻从浅生根向深生根转变，因而有可能增强水稻的抗旱性[14].

水稻具有高效的抗氧化酶系统，包括SOD、CAT和POD等.在不同的环境胁迫条件下，抗氧化酶和抗氧化代谢物的含量都有所增加，这种防御活性在耐旱性品种中表现得比干旱敏感性品种要高[16-17].在干旱胁迫条件下，有的研究报道了水稻SOD、CAT和POD活性增强[18]，而另有研究却得出了水稻SOD、CAT和POD活性下降的结论，这些抗氧化酶活性反应的差异可能与逆境的严重程度、持续时间[19]以及植物的耐旱能力[20]有关.

本研究旨在探讨不同杂交水稻品种在干旱环境下的根系分布和抗氧化酶活性对品种抗旱的影响，评价DRO1基因在试验品种根系分布变异中的作用，以为杂交水稻育种提供理论依据.

1 材料及方法

1.1 试验设计

以46个杂交水稻品种(见表1)作为试验材料，于2016—2018年在旱棚和水稻盆栽系统中对参试水稻品种进行干旱胁迫试验.其中，2016年为品种初筛试验，在旱棚进行；2017—2018为典型品种耐旱特性试验，在水稻盆栽系统中进行.

1.1.1 初筛试验

初筛试验采用完全随机区组设计，46个水稻品种共设计138个试验小区，每个品种3个重复.每个重复撒播150粒水稻种子.在三叶期移除病秧，保留100株健壮秧苗.待秧苗基本成长至四叶期时，停止灌溉，同时排干试验小区所有水分.每个试验小区每隔3 d选择10株代表性秧苗测定株高和叶片数；同时每隔3 d取3株秧苗测定生物量，直至所有水稻萎蔫死亡.在此基础上，将46个水稻品种分为3组，从每组中选择2个品种(共6个品种)作为典型水稻品种进行进一步研究.

表1 抗旱筛选水稻品种

1.1.2 典型品种耐旱特性试验

将内径为20 cm、高60 cm的PVC管放入内径为40 cm、高60 cm的硬塑料桶中.PVC管内衬尼龙网袋，装入稻田土形成土柱，每桶装土20 kg，PVC管上口高出土面10 cm；外桶灌水浸泡，静置沉淀2 d.根据综合耐旱指数选择6个水稻品种，在72个桶中播种，每个品种种植12桶，每桶移栽1株五叶期秧苗.为了减少营养胁迫对水稻生长的影响，在每桶土壤中分别混合施用3.5 g氮(N)、5.3 g磷(P2O5)和3.6 g钾(KCl).在水稻分蘖盛期，排干桶中所有水分，并停止灌溉，等水稻完全萎蔫后(大约一周)，每个品种选择3桶检测根系分布，3桶检测根系和叶片抗氧化酶活性；剩下6桶水稻进行复水灌溉，等水稻完全复活后，再次排干桶中所有水分，停止灌溉.等水稻第二次完全萎蔫后(大约5 d)，每个品种选择3桶检测根系分布，3桶检测根系和叶片抗氧化酶活性.

1.2 取样观测

1.2.1 根系分布

水稻第一次萎蔫时，每个品种选择3桶取样.将内桶取出，由土表向下将土柱分3层切割，洗去各层泥沙，分别测量表层(0～10 cm)、中层(10～30 cm)、深层(30～50 cm)不定根长度和数量；用干燥组织吸去根部表面水分，测定不同土层的根重.水稻第二次萎蔫时，每个品种选择3桶，对上层、中层和下层水稻根长、根数和根重进行测定.

1.2.2 根及叶片中的酶

水稻第一次萎蔫时，每个品种选择3桶取叶片和根样，检测抗氧化酶活性.叶样取法：剪取水稻自上而下的第二片与第三片叶，放入20 mL离心管，液氮保存.根样取法：由土表向下将土柱分层切割，洗去各层泥沙，留取中间层根条，放入20 mL离心管，液氮保存.

分别取0.20 g水稻叶片和水稻根系于预冷的研钵中，加入预冷的0.05 mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液1 mL，在冰浴上研磨成浆；吸入2 mL EP管，再加入1 mL缓冲液冲洗研钵，再吸入2 mL EP管，最终体积为2 mL.4℃下5 000 r/min离心20 min，上清液即为提取液.分装、编号，4℃保存备用，最后供测定SOD、POD和CAT活性指标，测定方法参照《植物生理生化实验原理和技术》[21].

1.2.3DRO1基因测序

剪下水稻叶片，用保鲜膜包裹，-20℃保存，用于基因测序.DRO1基因测序由成都市擎科生物公司完成.

1.3 统计方法

根据不同水稻基因型在干旱胁迫下生物量、株高和叶片的动态变化，采用下列公式计算水稻的综合耐旱指数(Complex tolerance index of rice under drought environment，Icd).

Icd=HI×0.1+BI×0.3+LI×0.6；

式中：HI是高度变化指数，BI是生物量变化指数，LI是水稻干旱胁迫的叶片变化指数；Hi是水稻第一个量度时间的株高，Hi+1是水稻第 (i+1)次测量的株高；Bi是水稻生物量，Bi+1是第(i+1)次测量的水稻生物量；Li是第一次测量的水稻叶片数，Li+1是第 (i+1)次测量的水稻叶片数；Di是水稻生长的日数，Di+1是水稻生长的第(i+1)日数；n是各指标总测量次数.

2 结果

2.1 干旱环境下水稻的综合耐旱指数

杂交水稻品种在干旱胁迫条件下表现多样，综合耐旱指数从0.84～0.55不等，根据综合耐旱指数值将水稻品种分为3组：0.75～0.84为耐旱型(C)，0.65～0.75为半耐旱型(H)，0.55～0.65(A)为干旱敏感型.共筛选出12个耐旱型品种、25个半耐旱型品种和9个干旱敏感型品种(见图1).从耐旱型(C)中选择德优4727和川谷优208，半耐旱型(H)中选择德香4103和蓉18优447，干旱敏感型(A)中选择B优2761和B优5768作为典型品种，进一步分析其抗旱性.

图1 46个水稻品种分类(部分数据)

2.2 根系分布分析

根是水稻吸收养分和水分的重要器官之一，其对水分的吸收利用能力对水稻抗旱能力具有显著影响.根系分布数据(见图2)表明，与敏感型水稻(B优2761和B优5768)根系相比，耐旱型水稻(德优4727和川谷优208)根系在10～30 cm和30～50 cm土层分别增长171和489 cm；但在0～10 cm土层，从敏感型向耐旱型根系的增长趋势不显著.在10～30 cm和30～50 cm土层，耐旱型水稻根系数量分别比敏感型多32和41个；在0～10 cm土层根系数量则无显著性差异.在0～10 cm和30～50 cm土层，耐旱型水稻根重显著大于敏感型，而在10～30 cm土层根重显著小于敏感型.以上结果表明，0～10 cm土层水稻根系密度差异不显著；30～50 cm土层水稻根系垂直分布差异显著，耐旱型水稻(德优4727和川谷优208)比敏感型水稻(B优2761和B优5768)在干旱胁迫条件下具有更深的根系，可以有效地利用深层水分，生存得更好.

2.3 深层生根基因DRO1序列分析

已有的研究[14-15]表明，DRO1基因参与水稻根系的深层发育，在干旱胁迫条件下可保证水稻产量的稳定性.基因测序结果表明，耐旱型水稻(德优4727和川谷优208)与干旱敏感型水稻(B优2761和B优5768)的第3外显子区均具有单核苷酸多态性(SNP).与耐旱型水稻(德优4727和川谷优208)相比，敏感型水稻(B优2761和B优5768)在752 bp区域的第3外显子区碱基表现为“A”而不是“C”(见表2).同时，半耐旱型水稻(德香4103和蓉18优447)表现为杂合子(H)，在同一区域同时含有“A”和“C”碱基(见表2).结果表明，第3外显子区中含有“C”碱基的杂交水稻品种在水平轴方向上根系生长角最大，在干旱胁迫条件下根系发育更深(见图3)，可以有效利用较深层的水分.

表2 不同杂交水稻品种DRO1基因序列分析

T1为分蘖盛期的第一次干旱处理，T2为复水后的第二次干旱处理.

图3 德优4727(C)、德香4103(H)和B优5768(A)根系的区别

2.4 干旱胁迫下的抗氧化酶活性

抗氧化酶活性测定结果(见表3)表明，干旱胁迫条件下耐旱型水稻(德优4727和川谷优208)、半耐旱型水稻(德香4103和蓉18优447)和干旱敏感型水稻(B优2761和B优5768)叶片SOD活性差异显著，POD活性差异不显著，CAT活性无显著性差异.根系抗氧化酶活性，尤其是SOD和POD活性，均高于叶片抗氧化酶活性.干旱胁迫条件下，耐旱型水稻表现出较强的抗氧化酶系统.

表3 干旱胁迫对不同品种水稻抗氧化酶活性影响 U/mg

2.5 相关性分析

相关分析表明，根系分布与综合耐旱指数具有良好的相关性.在10～30 cm和30～50 cm土层，根长、根数与综合耐旱指数具有显著的相关性(见表4)；在0～10 cm和30～50 cm土层，根重与综合耐旱指数同样具有显著的相关性(见表4).这说明30～50 cm土层的根长、根数和根重对杂交水稻抗旱能力具有重要影响.

综合耐旱指数与根系SOD和POD活性呈极显著相关(见表4)，相关系数分别为0.983和0.890.根系CAT活性和综合耐旱指数间不具有显著相关性(见表4).叶片SOD、CAT和POD活性与综合耐旱指数无显著相关性，CAT和POD活性与综合耐旱指数的相关性分别为0.668和0.648(见表4).和叶片相比，根系SOD和POD活性对水稻抗旱能力有更重要的影响.

表4 综合耐旱指数与根系分布及抗氧化酶活性相关性分析

DRO1基因与水稻的根长在10～50 cm土层呈显著正相关，与根数和根重在30～50 cm土层呈显著正相关(见表5)，表明DRO1基因与水稻根系具有良好的相关性，尤其在水稻根系分布较深的情况下.

DRO1基因与根系和叶片的SOD酶活性均呈正相关，与根系SOD活性呈显著正相关；与根系和叶片POD活性均呈正相关，与根系POD活性呈显著正相关(见表5)；与根系和叶片CAT活性无显著相关性(见表5).综合来看，DRO1基因与根系抗氧化酶活性呈良好正相关.

表5 DRO1基因与根系、抗氧化酶的相关性分析

3 讨论

3.1 水稻综合耐旱指数

据报道，干旱胁迫会造成植株整体生长的减缓，具体体现在植株高度降低和生物量减少等方面[5].本试验以株高、生物量和叶片数为基础，建立了水稻耐旱性的变异性分析方法，为水稻耐旱种质资源的筛选提供了依据.杂交水稻的综合耐旱指数值变化很大(0.55～0.84)，耐旱型品种为0.75～0.84，半耐旱型品种为0.65～0.75，干旱敏感型品种为0.55～0.65.本文根据综合耐旱指数值从46个水稻品种中筛选出12个耐旱品种，其中，嘉优727、川优5727和德优4727具有同一亲本——成恢727，F优498和川农优498具有同一亲本——蜀恢498，表明这些耐旱品种的抗旱性源于其亲本成恢727和蜀恢498，因此认为成恢727和蜀恢498可能具有抗旱特性.

综合耐旱指数值与根系分布和根系POD、SOD酶活性具有良好的相关性，尤其是在10～50 cm土壤中更为显著.这些结果表明，综合耐旱指数方法是一种有效的、可操作的水稻种质资源筛选方法.

3.2 水稻抗旱性与根系分布

植物抗旱性是一个复杂的性状，它与土壤质地、根系分布和水分条件等环境因子密切相关[22].根系作为植物从土壤中吸收水分和养分的重要器官，可通过吸收深层土壤水分来避免干旱，对植物的抗旱性起着至关重要的作用[23].本文研究了不同杂交水稻品种在表层、中层和底层土壤中根系分布情况，进一步阐明了根系发育基因型变异的重要性.与半耐旱型品种(德香4103和蓉18优447)和干旱敏感型品种(B优2761和B优5768)相比，耐旱型品种(德优4727和川谷优208)的根系更发达，这与早期的相关研究结果[14-15，24]一致.

3.3 DRO1基因与水稻根系

许多控制根系形态的数量性状基因座(QTL，quantitative trait locus)已经有过报道，但是对控制水稻深根性状的QTL的研究还比较有限.目前已有6个主要的水稻深根性状QTL[14-15，25-28]被报道.Kinandang Patong(KP)携带的功能性等位基因DRO1具有深根特性，而IR64携带的非功能性等位基因DRO1具有浅根特性[15].本研究中对一些典型的杂交水稻品种进行了DRO1基因测序，发现了其在第3外显子中的单核苷酸多态性.干旱敏感型品种中含有A，根系生长角度小，因此生根浅；耐旱型品种中含有C，根系生长角度大；半耐旱型品种中含有A和C，根系生长角度中等，表现为混合根表型(见表2、图3).这些结果表明，深根栽培品种携带功能等位基因DRO1的同时，其他两组所产生的蛋白质可能不具有正常功能.

3.4 水稻抗旱性与抗氧化酶

植物中抗氧化酶的诱导活性是一种自然的反应策略，用以对抗恶劣环境中的氧化损伤[29].SOD被认为是通过将活性氧转化为过氧化氢(H2O2)、再通过CAT和POD消除H2O2减少活性氧对植株伤害的关键酶[30-31].在各种抗氧化酶中，CAT和SOD在干旱环境下表现出较高的诱导活性；虽然POD也可受到诱导，但活性相对低于CAT和SOD.本试验的研究表明，干旱胁迫条件下，耐旱组水稻表现出较强的抗氧化酶系统；根系抗氧化酶尤其是SOD酶活性显著提升，降低了干旱胁迫对水稻植株的损害，对于提高水稻抗旱性具有重要意义，这与前人的研究结果[5]一致.根系SOD和POD活性在耐旱型、半耐旱型和干旱敏感型品种间差异显著(见表3)，这些结果为根系SOD和POD酶活性在水稻耐旱能力鉴定中起重要作用提供了依据.