黄宗顺， 肖 洁， 彭用华， 俞小敏， 陈亚琦

（广州医科大学附属第一医院肾内科，广东广州510120）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是肾功能在短期内下降而出现的氮质废物滞留和尿量减少的综合征。AKI 具有全球发病率高、预后不良和医疗费用高等严峻问题［1-6］。目前，AKI 的发病机制尚未明确。肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells，RTEC）凋亡是AKI 发生发展的重要病理改变之一，明确RTEC 凋亡的分子机制对AKI的防治具有重要意义。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）是广泛表达于各种组织的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与细胞凋亡密切相关［7-9］。CaMKII 在氧化应激损伤和细胞凋亡中发挥重要作用，敲除CaMKII基因或抑制其功能可缓解内质网应激诱发的心肌细胞凋亡［10］。也有研究认为，CaMKII 过表达可促进碘海醇诱导的线粒体损伤和 RTEC 凋亡［7］。目前，CaMKII 是否参与AKI 的发病及其在RTEC 凋亡中的机制仍未明确。因此，本研究采用阿霉素（adriamycin，ADR）干预人近端肾小管上皮细胞HK-2 和BALB/c 小鼠，分别建立 RTEC 凋亡细胞模型和 AKI 动物模型［11-12］；采用Western blot、流式细胞术和细胞转染等技术，初步探讨CaMKII 和活化T 细胞核转录因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）在 AKI 的 RTEC 凋亡中的作用和调控机制。

材料和方法

1 实验材料

1.1 细胞培养与分组 肾小管上皮细胞HK-2（购自ATCC）用含10%胎牛血清（Gibco BRL）的RPMI-1640 培养液（Gibco BRL）在37 ℃培养箱中培养。培养成熟的RTEC 予ADR（0.062 5 mg/L；购自Sigma）、KN-93 磷酸盐（简写为K；CaMKII 的特异性抑制剂；2 μmol/L；购自Selleck Chemicals）、钙调蛋白（calmodulin，CaM；CaMKII 活化剂；5 μmol/L）或siRNA（50 nmol/L）干预24 h。培养成熟的RTEC 按实验内容随机分组。第1～3 部分实验分为3 组：正常对照（control，Con）组、ADR 组和 ADR+K 组。第 4 部分实验分为 6 组：Con 组、siRNA 空白对照（siRNA blank control，siCon）组、ADR 组、ADR+NFAT-siRNA（siNFAT）组和CaM 组和CaM+siNFAT 组。siNFAT（序列为 5′-GCCATAACTTTCTGCAAGA-3′）和siCon 购自广州锐博公司。siRNA 的细胞转染方法详见我们的前期研究［12-15］和产品说明书。……