李冲,陈蕾蕾,谢俊霞

(青岛大学脑科学与疾病研究院(山东省神经相关疾病的机制与防治重点实验室，山东省沿海地区神经退变疾病协同创新中心),山东 青岛 266071)

帕金森病是世界第二大神经退行性疾病，典型病理特征是黑质致密带多巴胺能神经元进行性丢失，α-突触核蛋白的聚集和铁沉积[1-3]。越来越多的证据表明铁沉积会导致多巴胺能神经元死亡，铁过载是神经元死亡的诱因而非结果[4-5]。除了可以通过氧化损伤途径促进多巴胺能神经元死亡，大量的铁可以促进α-突触核蛋白的表达[6]，也可从蛋白翻译后水平影响其磷酸化[7-8]，促进蛋白聚积，进而损伤神经元[9-10]。随着年龄增加，多种器官发生铁聚积，脑内铁沉积随之不断加剧[11]，过量铁导致的氧化水平升高又会进一步引发铁蛋白释放[12]。细胞衰老是细胞无法进入细胞周期而处于停滞状态，是防止细胞不受调控持续增殖的机制，主要表现为炎性因子的分泌、β-半乳糖苷酶活性增加以及衰老相关分泌表型[13]。随着年龄的增加，衰老细胞在体内逐渐累积，衰老的细胞部分丧失生理活性，影响机体正常生理功能。在主要的神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病以及亨廷顿症病人脑内均发现了衰老的神经元和胶质细胞[14-15]。在疾病状态下的神经元也会出现衰老现象，据文献报道，在γ射线诱导的小鼠胚胎成纤维细胞衰老模型中，衰老细胞的铁水平是正常细胞的30倍之多[16]。另有研究发现，神经毒素百草枯可诱发与帕金森病相关的细胞衰老和神经病理特征[17]。最近有研究表明，诱导胚胎干细胞分化的多巴胺能神经元也观察到衰老表型[18]。已有实验证实，衰老细胞内铁含量明显升高，衰老导致的铁摄取和储存异常会影响铁介导的细胞死亡过程[11,16]，衰老的细胞若不及时清除，会进一步损伤周围细胞[19]。为了探讨铁过载能否引发神经元衰老进而引发死亡丢失，本研究用枸橼酸铁铵(FAC)对原代神经元进行处理，检测其衰老发生情况。

1 材料和方法

1.1 实验材料

FAC(Sigma)，胎牛血清(依科赛(澳洲源))，SA-β-Gal染色试剂盒(CST，9860S)，DMEM高糖培养液(Gibco，1210038)以及DMEM/F12培养液(Hyclone，SH30023.01)，D-多聚赖氨酸、B27(Gibco)，β-阿糖胞苷、青链霉素混合液、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(索莱宝)和倒置显微镜(OLYMPUS，IX73)。

1.2 实验方法

1.2.1中脑腹侧原代神经元培养 将深度麻醉的孕12～14 d的Wistar大鼠用医用乙醇喷洒消毒后，用手术剪沿大鼠的腹中线剪开至腹腔完全暴露，用镊子取出串珠样胚胎，放在预冷的DMEM培养液中，迅速转移至超净工作台上。用尖镊将胎鼠剥离出来，先在解剖显微镜下将中脑组织块取出转移至新鲜的DMEM培养液中，再在镜下修剪掉多余组织块和血管膜，保留蝴蝶状腹侧，加入适量胰蛋白酶，置37 ℃培养箱中孵育消化，5 min后加入终止液终止消化。用1 mL移液枪轻柔地吹打尽量使组织块分散，静置片刻后吸取上清至50 mL离心管中，重新加入新鲜的DMEM培养液5 mL，重复上述步骤3次。将上清以1 000 r/min离心5 min后弃上清，加入含有B27的DMEM/F12完全培养液，轻轻吹打成均匀的单细胞悬液，接种到12孔板上，每孔1×105个细胞，放入细胞培养箱中培养，1 d后更换一半培养液，此后每隔2 d更换新鲜培养液，7 d后成熟的神经元可用于后续实验。经β-阿糖胞苷处理，神经元纯度达90%以上，符合实验要求。

1.2.2实验分组及处理 将细胞随机分为对照组和实验组。实验组细胞加入100 μmol/L的FAC作用24 h，对照组细胞用不含FAC的低血清培养液进行处理。

1.2.3细胞衰老相关β-半乳糖苷酶活性检测 应用SA-β-Gal染色试剂盒检测细胞衰老相关β-半乳糖苷酶活性。FAC处理24 h后，用0.01 mol/L PBS润洗细胞2次，每次30 s，每孔细胞加入1 mL固定液，室温固定15 min，用0.01 mol/L PBS冲洗细胞2次，每次30 s，弃掉洗液，每孔加入1.5 mL染色液，用封口膜密封细胞培养板防止染液蒸发，置37 ℃恒温箱中孵育过夜。用0.01 mol/L PBS润洗细胞2次，每次30 s，在奥林巴斯倒置显微镜明场下观察并获取图像，阳性细胞显示为亮蓝色。

1.3 统计学分析

2 结 果

与对照组相比较，实验组细胞衰老相关β-半乳糖苷酶阳性染色明显增强(图1)，对照组着色细胞比例为(2.077±0.440)%，实验组着色细胞比例为(25.200±1.164)%，两组比较差异具有统计学意义(n=3，t=18，P<0.05)。提示100 μmol/L FAC作用于原代神经元24 h，细胞衰老相关β-半乳糖苷酶活性增加，表明100 μmol/L FAC可以诱导原代神经元发生衰老。

3 讨 论

铁是维持生命活动的关键微量金属元素之一，在中枢神经系统中发挥重要作用，参与脑内线粒体呼吸、轴突髓鞘化以及神经递质的形成[12]。铁作为活泼金属，也可以催化多种生化反应，增加氧化应激，过量的活性氧损伤细胞膜、核酸及蛋白结构，引发细胞毒性[20]。枸橼酸是铁的天然螯合剂，枸橼酸铁为枸橼酸与铁离子形成的铁盐，是美国食品和药物管理局(FDA)批准的补铁药剂[21]。本实验所用的FAC是枸橼酸铁更具溶解性的形式，添加FAC可模拟高铁环境，以探讨铁过载对神经元细胞衰老的影响。

对于体外培养细胞的衰老研究，衰老相关的β-半乳糖苷酶的活化是常用的生物学特征[22-23]。β-半乳糖苷酶是溶酶体水解酶，通常在pH值为4时表现出活性；而在衰老的细胞中，pH值为6时有活性，利用β-半乳糖苷酶底物进行染色，就能从正常细胞中区分出衰老细胞[24]。本实验采用100 μmol/L FAC处理原代神经元24 h，观察到β-半乳糖苷酶的阳性染色明显增强，提示细胞衰老的发生。

越来越多的证据表明，铁稳态失衡促进神经退行性疾病的发展[25-28]，铁沉积是帕金森病一个主要的病理特征，也是人们普遍认为的发病诱因。有研究证实，细胞内铁过载会增加氧化还原水平[29-30]，促进α-突触核蛋白的聚积，进而发挥细胞毒性作用，如二价铁可以通过与α-突触核蛋白mRNA的C端ASP-121、Asn-122、Glu-123位结合，在转录水平促进α-突触核蛋白表达，也可以在转录后水平参与蛋白磷酸化等修饰过程，促进蛋白聚集发挥细胞毒性作用[31-32]，并且α-突触核蛋白寡聚过程产生活性氧是铁依赖性的[33]。铁过载增加细胞内氧化应激水平可能是诱导衰老的重要机制。本实验结果表明，铁过载会诱发神经元衰老，这为后续进行神经元变性死亡研究提供了新的思路。但处于衰老状态的神经元细胞是通过何种通路逐渐死亡丢失，神经元衰老与目前已知凋亡、坏死和铁死亡之间是否存在因果或先后关系，衰老在神经元变性死亡过程中的具体机制还有待进一步的研究探讨。