杨燕霞，王 欣，魏素珍，马 斌，柳小平

(西北民族大学 甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 730030)

0 引言

过敏性哮喘是一种呼吸道变态反应性疾病，主要表现为咳嗽、喘息和可逆性气道阻塞[1].过敏性哮喘发病率高且治疗困难，给病人造成较重的经济负担.传统认为，气道高反应性(AHR)、肺部炎症、嗜酸性粒细胞增多和黏液增生是过敏性哮喘的标志[2].在过敏性哮喘发病过程中，嗜酸性粒细胞、T细胞、肥大细胞、树突状细胞和中性粒细胞等免疫细胞均参与了气道免疫炎性反应，并与患者的症状密切相关[3].然而关于这些免疫细胞参与过敏性哮喘发病过程的分子机制目前尚不清楚.随着基因组在医学基础研究中的应用，生物信息学已经成为揭示疾病分子机制的一种重要工具.郭黎彦等[4]应用加权共表达网络探究了支气管哮喘中的关键基因和信号通路.Shan等[5]应用生物信息学鉴定了维生素D受体在支气管哮喘中的作用.目前还没有系统评价免疫细胞浸润情况的研究.CIBERSORT[6]是一种基于基因表达谱数据分析免疫细胞浸润情况的新方法.R语言即可以进行大数据分析，又可以进行数据可视化，已经成为生物信息学必不可少的分析工具.在该研究中，我们既分析了过敏性哮喘发病过程中关键的基因和信号通路，又应用CIBERSORT对支气管哮喘患者免疫细胞浸润情况进行分析，以便从免疫细胞浸润方面阐述支气管哮喘的发病机制.研究结果既为过敏性哮喘发病机制研究提供参考，又有助于开发过敏性哮喘新的治疗方法.

1 材料和方法

1.1 数据来源

GEO(Gene Expression Omnibus,GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[7]是一个公共的基因组学数据库，收集了大量疾病的功能基因组数据集.我们使用R语言GEOquery包[8]从GEO数据库下载了支气管哮喘基因数据集GSE63142中的表达谱数据.数据集GSE63142中的样本均来源于人.此平台基于GPL6480 Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F(Probe Name version).数据集GSE63142中共有155例支气管上皮的样本，其中包括哮喘病人样本128例和正常人样本27例.

1.2 原始表达谱数据预处理

我们使用R语言中affy包对GSE63142中的原始基因表达谱数据进行背景校检、归一化处理，并使用密度图和二维PCA聚类图展示原始数据预处理前后的结果.使用R语言中的limma包对基因表达矩阵进行差异表达分析，从而得到差异表达基因.

1.3 免疫基因的GO分析、KEGG通路分析与GSEA分析

基因本体论(gene ontology,GO)可对基因参与的生物过程进行注释.京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)是一个手工绘制的信号通路数据库，可对参与疾病发病机制中重要的信号通路进行注释.基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)是用来评估一个预先定义的基因集中的基因在与表型相关度排序的基因表中的分布趋势，从而判断其对疾病的作用.使用R语言clusterProfiler包进行GO分析、KEGG通路富集和GSEA分析，发现显著性基因富集的临界值为P<0.05.

1.4 蛋白互作网络构建与关键基因的筛选

STRING数据库(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING)(http://string-db.org;version:11.0)是用于注释蛋白质—蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络的在线工具，分析蛋白质之间的相互作用，可以对疾病中复杂的调控机制进行注释.Cytoscape软件可对PPI网络进行可视化处理，其插件cytoHubba可用于识别PPI网络中的Hub节点.将所有的免疫基因导入STRING数据库分析并通过Cytoscape构建PPI网络，再通过插件cytoHubba识别Hub基因.利用GOSemSim包和clusterProfiler包计算Hub基因分子功能和细胞组分的相似性，从而分析得到Hub基因的相似程度.

1.5 免疫细胞浸润的可视化及评价

CIBERSORT(https://cibersort.stanford.edu/)是基于线性支持向量回归的原理对免疫细胞亚型的表达矩阵进行去卷积的一个网页工具，可用来估计免疫细胞浸润情况.将GSE63142中的基因表达矩阵数据上传到CIBERSORT，过滤输出P<0.05的样本，得到免疫细胞的表达矩阵.为了评价免疫细胞在过敏性哮喘中的浸润情况，我们监测了免疫细胞浸润的差异、免疫细胞浸润的相关性和免疫细胞相互作用的网络.R语言ggplot2包绘制小提琴图展示了22种免疫细胞浸润的差异；R语言corrplot包绘制相关热图以展示22种免疫细胞之间的相关性；R语言igraph包绘制免疫细胞浸润的相关网络图以展示22种免疫细胞浸润的互作情况，以P<0.05、|相关系数|>0.15为互作标准.

1.6 TIMER数据库相关分析

TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是系统分析各种疾病类型免疫渗透的数据库，利用这个数据库可统计6种免疫浸润细胞(B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞)与基因的相关性.使用TIMER数据库对分析结果进行初步验证，再用TIMER数据库对免疫细胞与过敏性哮喘中Hub基因进行相关性分析.

2 结果

2.1 原始数据预处理

对原始基因表达谱数据进行背景校检、归一化处理，并利用密度图和二维PCA聚类图对原始数据预处理的效果进行展示.密度图结果表明，原始数据均一化效果良好(图1A、B)；二维PCA聚类图表明，样本能够分开，来源可靠(图1C、D)，可用于后续的分析.我们通过差异表达分析，共得到1 181个差异表达免疫基因.

A、B.原始数据背景校检、标准化处理前后基因表达密度图；C、D.原始数据预处理前后的PCA聚类图.

2.2 免疫基因的GO分析、KEGG通路分析与GSEA分析结果

对1 181个差异表达进行GO分析和KEGG分析.GO分析结果表明(图2A)：过敏性哮喘发病主要与谷胱甘肽衍生物生物合成、谷胱甘肽衍生物代谢过程、核苷酸-糖代谢过程、谷胱甘肽转移酶活性、花生四烯酸代谢过程、蛋白质N-连接糖基化、长链脂肪酸代谢过程、糖基化、大分子糖基化、蛋白质糖基化和细胞修饰氨基酸代谢等生物过程相关.KEGG分析结果则表明(图2B)：花生四烯酸代谢、炎症介质对TRP通道的调节、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路和Fc-epsilon-RI信号通路等与过敏性哮喘的发病机制关系密切.对基因表达矩阵进行GSEA分析，结果表明：IL-17信号通路、Th1和Th2细胞分化、Th17细胞分化、肿瘤坏死因子信号通路和细胞因子—细胞因子受体相互作用等通路可能参与了过敏性哮喘的发病机制.

2.3 PPI网络和Hub基因

利用STRING数据库构建了PPI网络，使用Cytoscape软件进行可视化的结果如图3A所示.通过cytoHubba插件共得到10个Hub基因(图3B)：C3、CX3CL1、NMU、CXCL2、ADORA3、SUCNR1、ACKR3、CXCL3、CXCL6和OPRL1.基于MF和CC来注释并计算Hub基因间的相似性，结果表明(图3C)：CXCL3、CX3CL1、CXCL6和CXCL2具有结构和功能的相似性，C3、ACKR3和OPRL1具有结构和功能的相似性，ADORA3和SUCNR1具有结构和功能的相似性.

A.GO分析结果；B.KEGG分析结果；C.GSEA分析结果.

A.PPI网络；B.Hub基因相互作用网络；C.Hub基因结构和功能的相似性.

2.4 过敏性哮喘免疫细胞浸润结果

22种免疫细胞浸润的差异结果显示(图4A)：与非哮喘病人比较，过敏性哮喘的病人支气管中出现明显的单核细胞、M0巨噬细胞、树突状细胞和中心粒细胞浸润.22种免疫细胞相关性热图(图4B)结果则显示：单核细胞与M0巨噬细胞、树突状细胞呈负相关，而单核细胞与中性粒细胞呈正相关；M0巨噬细胞与树突状细胞也呈负相关，而与中性粒细胞呈正相关；树突状细胞和中性粒细胞呈正相关.22种免疫细胞互作网络图(图4C)结果则显示，中心粒细胞与单核细胞、M0巨噬细胞和树突状细胞具有明显的相关性，M0巨噬细胞和树突状细胞关系密切，而M0巨噬细胞与单核细胞相关性较弱.

2.5 TIMER数据库相关分析

为了进一步探究免疫细胞浸润与过敏性哮喘发病机制的关系，我们利用TIMER数据库分析了免疫细胞与10个Hub基因的相关性(图5).结果表明：树突状细胞与CXCL3、CXCL2突变相关，M0巨噬细胞与SUCNR1、OPRL1、ACKR3突变相关，单核细胞与OPRL1、CXCL3、CXCL2、C3等基因突变相关，而与中性粒细胞相关的突变基因只有CXCL3.

图5 Hub基因与免疫细胞的相关性热图

A.过敏性哮喘中免疫细胞浸润的丰度；B.免疫浸润相关性热图；C.免疫细胞相互作用网络.

3 讨论

过敏性哮喘发病主要是由于自体免疫耐受受损.目前，研究者认为[8-11]，外界刺激导致CD4+Th2细胞分泌IL-4，IL-5，IL-9、IL-13、IL-25和IL-17等亚类细胞因子，这些细胞因子可通过刺激B细胞生长、启动免疫球蛋白同种型转换为IgE、肥大细胞的分化、嗜酸性粒细胞增多、细胞吞噬作用和纤维化等，从而使病人产生症状.除此之外，气道中的黏膜免疫细胞，如先天淋巴样细胞(ILC，巨噬细胞，树突状细胞)和适应性免疫细胞(如BandT淋巴细胞)在过敏性哮喘的发病机制中也起着重要作用[12-13].目前，虽然研究者对过敏性哮喘的发病机制进行了大量的研究，但关于过敏性哮喘的分子免疫机制仍然不清楚.因此，利用生物信息学的分析方法，可对过敏性哮喘后的关键免疫基因和信号通路进行筛选，又能对免疫细胞的作用模式进行分析.

为了注释过敏性哮喘发病过程中基因的功能，我们对差异表达基因进行GO分析和KEGG分析，也对基因表达矩阵进行GSEA分析.通过KEGG分析富集到了炎症介质对TRP通道的调节、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路和Fc-epsilon-RI等信号通路.GSEA分析主要富集到IL-17信号通路、Th1和Th2细胞分化、Th17细胞分化、肿瘤坏死因子信号途径和细胞因子-细胞因子受体相互作用等信号通路.TRP通道是一种瞬态受体电位离子通道，抑制TRP通道可缓解支气管哮喘患者的咳嗽症状，是气道疾病症状缓解药物的新兴分子靶标候选物[14].Fc-epsilon-RI受体是IgE高亲和力受体，过敏性哮喘发病过程中产生的嗜酸性粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞会表现高亲和力的Fc-epsilon-RI受体.IgE与该受体结合在过敏性哮喘的免疫级联反应中发挥着重要作用[15-16].Th1和Th2细胞分化在过敏性哮喘中的作用较为明确，常常作为过敏性哮喘的治疗靶细胞[17-18].气道中本没有Th17细胞，但在过敏性哮喘发病过程中，Th17细胞转移至气道中以适应不良的免疫反应，与严重的气道高反应性、黏液产生以及嗜酸性/嗜中性粒细胞混合炎症密切相关[19-20].在我们富集分析的结果中，只有肿瘤坏死因子信号通路和IL-17信号通路在过敏性哮喘中的作用目前尚未报道.我们的研究有助于发现过敏性哮喘发病过程中新的信号通路.

通过构建PPI网络，共筛选得到10个Hub基因:C3、CX3CL1、NMU、CXCL2、ADORA3、SUCNR1、ACKR3、CXCL3、CXCL6和OPRL1.C3是血清中含量最高的补体成分，主要由巨噬细胞分泌，在补体经典激活途径和旁路激活途径中均发挥重要作用.相关研究表明[21-23]，C3可通过与C3a受体结合来调节白细胞激活、平滑肌收缩和血管通透性，但是关于C3补体引起支气管哮喘病人症状的原理尚不清楚，有待进一步的研究.Wallrapp等研究表明[24]，NMU主要通过激活2型先天性淋巴样细胞(ILC2)引起过敏性哮喘中的病理性炎症反应.趋化因子家族在过敏性哮喘发病过程中也发挥着重要的作用.Goleva等[25]通过RT-PCR实验表明，CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8(IL-8)等在过敏性哮喘中的转录本水平明显升高.在过敏性哮喘发病过程中，CXCL2和CXCL6的激活能够吸引中性粒细胞聚集到气道中[26]，而CX3CL1主要通过调节单核细胞迁移和巨噬细胞分化以及T细胞依赖性炎症反应在过敏性哮喘发病过程中发挥作用[27-28].目前，关于SUCNR1、OPRL1、ACKR3和ADORA3在过敏性哮喘中的作用尚不清楚，有待进一步的生物实验验证.

对22种免疫细胞浸润的丰度进行分析，结果表明：与非哮喘病人相比较，过敏性哮喘的病人支气管中出现明显单核细胞、M0巨噬细胞、树突状细胞和中心粒细胞浸润.在过敏性哮喘中，单核细胞替代胚胎肺泡巨噬细胞而发挥作用.单核细胞的TLR信号能够促进Th2介导的嗜酸性粒细胞增多和Th1/Th17介导的嗜中性粒细胞增多[29-30].树突状细胞(DC)是一种抗原呈递细胞.树突状细胞可通过分泌的趋化因子和炎性因子刺激CD4+T细胞活化，并分化为Th1T细胞、Th2T细胞和Th17T细胞,参与过敏性哮喘中的炎性反应[31-33].中性粒细胞主要通过分泌IL-6、IL-8、IL-13、CM-CSF和TGF-β等炎性因子参与哮喘中的炎性反应[34].以上的研究与我们分析的结果类似，说明我们的分析结果具有一定的可靠性.而M0巨噬细胞在过敏性哮喘发病过程中的作用目前尚未报道，有待进一步的研究.

分析过敏性哮喘发病过程，在免疫浸润的基础上揭露了免疫浸润的细节.单核细胞与M0巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞密切相关.M0巨噬细胞与树突状细胞和中性粒细胞具有一定的相关性，树突状细胞的浸润和中性粒细胞的浸润相关.Radermecker等[35]研究表明，中性粒细胞可通过释放CXCR4增强树突状细胞的抗原提呈作用.Machiels等研究表明[36]，单核细胞衍生的肺泡巨噬细胞具有可抑制树突状细胞激活辅助Th2 T细胞的作用.本研究进一步说明，我们的分析真实可靠，但对于免疫细胞间的共同作用仍然有待进一步的研究.

Hub基因与免疫细胞相关性分析的结果表明，树突状细胞与CXCL3、CXCL2突变相关，M0巨噬细胞与SUCNR1、OPRL1、ACKR3突变相关，单核细胞与OPRL1、CXCL3、CXCL2、C3等基因突变相关，中性粒细胞与CXCL3的突变相关.Mizutani等研究表明[37]，IL-33与IL-17A共同通过CXCL2-CXCR2信号传导增强过敏性哮喘发病过程中中性粒细胞浸润.我们的分析结果详细地描述了过敏性哮喘发病过程中关键基因与免疫细胞浸润的相关性，具有一定的参考价值.

综上所述，应用生物信息学的分析方法可得到过敏性哮喘发病过程中的关键基因、信号通路和免疫细胞浸润的情况，既为过敏性哮喘分子机制的研究提供了一定的参考，也有助于开发过敏性哮喘的新的靶向药物.