严专强 麦凯杰 罗翠芬 周祺 杨德鸿 申翰钦 周庆丰

摘 要：为调查禽多杀性巴氏杆菌的流行情况，本研究从我国华东、华南和西南等区域8个省市家禽养殖场疑似禽霍乱发病群中分离出17株多杀性巴氏杆菌。血清型鉴定发现所有分离株均为荚膜A型。药敏结果显示分离株对阿莫西林、氨苄西林、头孢曲松、头孢吡肟和复方新诺明等药物敏感，对卡那霉素、四环素、庆大霉素和链霉素等药物耐药。

关键词：多杀性巴氏杆菌;分离鉴定;血清型;耐药性

中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2021）11-0045-06

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida， PM）是引起禽类禽霍乱、猪萎缩性鼻炎、牛羊出血性败血症等疾病的重要致病菌，家禽急性感染通常可见肺部出血，肝脏、脾脏有大量白色坏死点，死亡率较高[1]。多杀性巴氏杆菌的血清型根据荚膜抗原可分为A、B、D、E和F五个型，禽霍乱常由A和F型多杀性巴氏杆菌引起[2]。根据血清型制备灭活疫苗进行免疫是一种有效的预防措施，由于疫苗对异源血清型菌株的保护有限，因此监测流行菌株的血清型非常有必要。临床生产中多用抗生素进行治疗，随着菌株对常用药物敏感性的降低，药物治疗越来越困难。本研究通过调查不同地区禽多杀性巴氏杆菌的流行血清型和耐药情况，旨在为临床禽霍乱疾病的防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

TSA（Tryptic Soy Agar）和TSB（Tryptic Soy Broth）培养基，购自美国BD公司;胎牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司;2 × PCR mix，购自南京诺唯赞生物科技有限公司;药敏片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2 样本采集与细菌分离

2018～2021年从浙江、福建、广东、江苏、四川、重庆、湖南和贵州8个省市的规模化养殖场采集疑似禽霍乱发病禽群肝脏或头部样品共17份，并将采集的样品于2～8 ℃条件下当天带回实验室进行瑞氏染色镜检和细菌分离。

无菌使用接种环取样品划线于添加5%胎牛血清的TSA平板，于37 ℃条件下在5%CO2恒温培养箱培养18～36 h，然后挑取大小均一的优势单菌落于添加5%胎牛血清的TSB培养基中放37 ℃摇床200 r/min纯化培养12～24 h。

1.3 PCR鉴定

取纯化培养的菌液制备DNA模板，以多杀性巴氏杆菌标准菌株CVCC 44801作为阳性对照，根据GenBank登录号CP058991.1序列设计一对引物QI（表1），与文献报道的引物（KMT）进行二重PCR鉴定[3]，同时出现与预期片段大小一致的两条带则可确诊为多杀性巴氏杆菌。根据文献报道[3]多杀性巴氏杆菌荚膜分型方法，合成相应引物（表1）进行PCR鉴定分型，确定其荚膜血清型。菌液鉴定和荚膜分型PCR反应条件均为：95 ℃预变性3 min;循环内95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸按照1 000 bp延伸1 min，總35个循环;72 ℃后延伸10 min。产物进行电泳后于凝胶成像仪观察。

1.4 药敏试验

多杀性巴氏杆菌对营养有一定要求，因此本试验使用添加5%胎牛血清的TSA平板进行药敏试验（K-B法）。将培养好的纯化菌液调整浓度至OD600=0.08～0.13，使用灭菌棉签将菌液均匀涂布于2块TSA平板上，放置10～15 min后将阿莫西林、大观霉素、环丙沙星、头孢曲松、氨苄西林、头孢吡肟、卡那霉素、四环素、庆大霉素、强力霉素、复方新诺明和链霉素共12种抗生素药敏片均匀贴于平板上，药敏片之间至少间隔2 cm以上，于37 ℃条件下在5%CO2恒温培养箱培养18～36 h。根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）的标准来判断菌株耐药性。

2 结果

2.1 多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

从浙江、福建、广东、江苏、四川、重庆、湖南、贵州8个省市的规模化养殖场共分离出17株多杀性巴氏杆菌，其中番鸭源分离株13株，黄羽肉鸡源分离株4株（表2）。病料样品瑞氏染色镜检可见大小不一、两极浓染的短杆状细菌，分离菌在TSA平板培养呈现透明的圆形、露珠状菌落，见图1。

2.2 PCR鉴定

特异性鉴定引物扩增结果显示，分离菌株的QI引物扩增片段长度为305 bp，KMT引物扩增片段长度为460 bp，均与多杀性巴氏杆菌标准菌株CVCC 44801的标准阳性对照片段大小相符，鉴定确诊为多杀性巴氏杆菌（图2）。荚膜分型结果显示所分离菌株扩增片段长度为1 044 bp，与预期的Type A扩增片段长度一致，结果表明分离的17种巴氏杆菌均为荚膜A型（图3）。

2.3 药敏试验

药敏试验结果显示，阿莫西林、头孢曲松、头孢吡肟、复方新诺明、氨苄西林对分离株抑菌效果最好，分别有100%、100%、100%、100%、94.1%的菌株敏感。对卡那霉素、四环素、链霉素、庆大霉素的耐药菌株最多，占比分别为35.3%、35.3%、35.3%、29.4%（表3）。

3 讨论

多杀性巴氏杆菌在养禽业中有着较大的危害，通常以散在爆发的形式流行于各个地区[4，5]。本研究分离的17株巴氏杆菌来自我国华东、华南和西南等区域8个省市的水禽和黄羽肉鸡主养殖区，流行区域跨度较广。从菌株分离时间来看，该疾病常年均可发生，但在高温、高湿、多雨的夏秋季节分离率显著升高。因此在该疾病流行区域，应在高发时间段前，通过加强生物安全或疫苗免疫等方式着重进行预防。

本研究药敏试验结果显示分离株对阿莫西林、头孢曲松、复方新诺明等青霉素类、头孢菌素类和磺胺类抗生素十分敏感，对卡那霉素、链霉素、庆大霉素等氨基糖苷类抗生素和四环素类抗生素较为耐药。本研究药敏结果与陶娅等[4]、Xiao等[5]报道的药敏结果比较一致，与陈国权等[6]、王红琳等[7]报道的药敏试验结果有很大不同，提示多杀巴分离株耐药性存在差异，可能与不同区域养殖场的禽霍乱发病频率和治疗用药习惯有关。

本研究揭示了我国部分地区禽巴氏杆菌的流行血清型和菌株耐药情况，为禽霍乱疾病的免疫防控和药物治疗提供了数据参考。

参考文献：

[1] WILKIE I W， HARPER M， BOYCE J D， et al. Pasteurella multocida： diseases and pathogenesis [J]. Curr Top Microbiol Immunol， 2012， 361： 1-22.

[2] CARTER G R. Studies on Pasteurella multocida. I. A hemagglutination test for the identification of serological types[J]. Am J Vet Res， 1955， 16： 481-484.

[3] TOWNSEND K M， BOYCE J D， CHUNG J Y， et al. Genetic organization of Pasteurella multocida cap Loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J]. J Clin Microbiol， 2001， 39： 924-929.

[4] 陶婭，王铉皓，李军朝，等.禽源多杀性巴氏杆菌的分离及生物学鉴定[J]. 中国兽医杂志，2019，55（04）：92-94.

[5] Xiao J F， Li Y J， Hu Z H， et al. Characterization of Pasteurella multocida isolated from ducks in China from 2017 to 2019[J]. Microb Pathogenesis， 2021，160： 105196.

[6] 陈国权，张旭，阎朝华，等. 鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 中国畜牧兽医，2020，47（02）：620-628.

[7] 王红琳，卢琴，张腾飞，等.鸭源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定[J]. 湖北农业科学，2019，58（12）：116-119.