邢超 徐灵巧 叶钟泰 张志光

1深圳市宝安区人民医院口腔科 518101；2中山大学光华口腔医学院附属口腔医院口腔颌面外科，广州 510055

由于软骨缺乏血管营养供应，特殊的生理特性一旦发生表层缺损难以自愈，导致骨关节病的发生［1］。随着病变的不断进展，关节功能退化、咀嚼功能受损，严重影响生活质量。当前修复颞下颌关节软骨缺损尚无有效的治疗手段，如保守治疗缓解疼痛，阻止病程进展，但在恢复软骨再生方面作用有限［2-4］。自体软骨移植，开辟第二术区造成供区缺损，且来源有限；人工关节费用高，存在并发症，严格适应症选择［5-6］。目前，再生医学的发展为关节软骨的修复再生提供新的选择，间充质干细胞（mesenchyme stem cell，MSCs）来源于体内多种组织，包括骨髓腔、关节滑膜组织、牙周膜、牙髓组织等，在体内外均具有软骨分化潜能［7］。外泌体是一类直径40～100 nm 的细胞外囊泡，携带核酸和蛋白质等多种生物活性内容物，参与细胞间信号传递、信号转导和信息交流。已有研究表明干细胞来源的外泌体具有与干细胞相似功能，可以辅助组织修复再生、抑制细胞凋亡、发挥免疫调节和抗炎作用［8］。干细胞来源的外泌体在脑与神经系统损伤、心血管系统、肝脏损伤、肾脏损伤、骨骼与肌肉系统等方面表现出强大的修复和再生能力，甚至能够替代干细胞开启“无细胞”治疗［9-12］。蛋白多糖是软骨细胞生长代谢、发挥功能的一个重要指标［13］。本研究旨在探索外泌体与髁突软骨细胞蛋白多糖之间的关系，观察在外泌体的作用下，髁突软骨细胞单位DNA 中氨基聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的含量及基因表达，从而为外泌体修复髁突软骨缺损提供实验基础。

1 资料与方法

1.1、 材料与试剂 研究时间为2019年1月至2021年1月（其中动物实验部分2014年做）。实验用100 g左右SPF级雄性SD 大鼠，动物由中山大学北校区动物中心提供，许可证号SCXK（粤）2011-0029，实验方法符合动物伦理学要求。鲨鱼硫酸软骨素（Sigma，美国）；FBS（Gibico，美国）；Anti-Collagen Type I Rabbit pAb（Calbiochem®，德国）；Anti-Collagen II（SIGMA-ALDRICHTM，美国）；DyLight 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit gG（H+L）（ EARTHoX.LLC，美国）；小牛胸腺 DNA（Sigma，美国）；L-cysteine（Sigma，美国）；Hoechst 33258（Sigma，美 国）；TRIzol® Reagent（Ambion，美国）；cDNA 逆转录试剂盒（Roche，瑞士）；SYBR Green Mix（Roche，瑞 士）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific，美国）；倒置显微镜下（Axiovert 40，Zeiss，德国）RT-PCR Primer（Invitrogen，美国）；Real-time PCR 仪（Roche，德国）；全自动酶标仪（Tecan Infinite200，瑞士）。

1.2 细胞获取与鉴定

1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的获取及鉴定 从大鼠腹腔注入1%戊巴比妥钠麻醉剂0.5 ml，手术分离双侧下肢股骨，去除骨头两侧的骨骺端，使用含10%FBS的a-MEM 冲洗骨髓腔，将冲洗出的液体置于25 cm²无菌的培养瓶中，48 h 后换液将未贴壁的血细胞冲洗去掉。每隔3～4 d换液1次，细胞长满培养瓶的80%后1∶3传代。分别进行成骨、成脂及成软骨诱导，验证其多向分化能力。

1.2.2 大鼠髁突软骨细胞的获取及鉴定 在麻醉状态下，将髁突及其附着物取出［14］。切取半透明的软骨中央部分，放入0.25%的胰酶的培养瓶中消化30 min（每5～10 min震荡混匀1 次），0.2%II 型胶原酶消化3 h，将所有收集的细胞转移至25 cm²无菌的培养瓶中，10% FBS 的低糖型培养基（L-DMEM）培养，每隔3～4 d 换液，待细胞长满培养瓶80%后传代。将获取的细胞进行II型胶原抗体免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜下观察。

1.3 外泌体的提取、鉴定及分组 培养皿中骨髓间充质干细胞量达到80%时，去除上清液并加入无血清培养基培养72 h，收集上清液。在4 ℃条件下，进行差速离心：2 000 g离心 30 min，20 000 g 离心60 min，100 000 g 离心60 min，收集离心管底部沉淀，PBS 稀释，100 000 g 离心 60 min，100 μl PBS 重悬沉淀物，放入-80 °C 冰箱保存备用。透射电子显微镜观察外泌体形态，纳米颗粒追踪分析外泌体粒径，蛋白印迹检测外泌体标记物。取P1 代髁突软骨细胞置于不含FBS 的 L-DMEM 培养 24 h，实验组加入 100 μl 包含外泌体的PBS，对照组加入100 μl PBS，分别置于37 ℃，含5%二氧化碳，95%空气饱和湿度的细胞培养箱中培养，每周换液2～3次。

1.4 髁突软骨细胞GAG 含量测定 取100 μl 质量浓度分别为：20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml 鲨鱼硫酸软骨素标准液，空白对照组加入ddH2O，每孔各加入2 ml 二甲基亚甲蓝（DMMB）混匀，酶标仪525 nm下测吸光度值，绘制GAG 含量的标准曲线［15］。以鲨鱼硫酸软骨素标准液的浓度为Y，吸光度值为X，做线性回归得一标准曲线方程（Y=a·X+b，a、b为常数）。

取两组髁突软骨细胞，加入1 ml 的木瓜蛋白酶60 ℃水浴箱过夜（＞16 h）。取100 μl消化液（每个样本设置3个平行对照组），加入2 ml DMMB，酶标仪525 nm下测吸光度值。根据标准曲线方程计算出细胞内GAG 含量，细胞内GAG 含量=a·吸光度值+b。

1.5 髁突软骨细胞DNA 含量测定 取牛胸腺DNA 作为标准液分别稀释成0、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml溶解于TNE缓冲液中，取40 μl不同浓度的牛胸腺DNA标准液加入到 96 孔板。室温避光条件下加入 Hoechst 33258（10 μg/ml）160 μl，荧光酶标仪下测 excitation 358 nm 、emission 458 nm吸光度值［16］。以牛胸腺DNA 标准液的浓度为Y，吸光度值为 X，做线性回归得一标准曲线方程（Y=a·X+b，a、b 为常数）。

取两组髁突软骨细胞，加入1 ml 的木瓜蛋白酶60 ℃水浴箱过夜（＞16 h）。取40 μl 消化液，加入160 μl Hoechst 33258（10 ug/ml），荧 光 酶 标 仪 下 测 excitation 358 nm 、emission 458 nm 吸光度值，根据标准曲线方程计算出细胞内DNA含量（细胞内DNA含量=a·吸光度值+b）

1.6 反转录聚合酶链反应（RT-PCR） 按2×105/瓶接种P1 代髁突软骨细胞至25 cm 培养瓶，Trizol 分别提取培养7、14 d 髁突软骨细胞RNA 并测定浓度。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒进行反转录合成cDNA，SYBRGreen QPCR Master Mix 试剂盒进行定量PCR。结果分析按照Livak 等［17］的方法计算实验组与对照组相对CT 值（2-△△Ct），每个样本重复 3 次，采用 GAPDH 作为管家基因，分析GAG 基因表达情况，基因引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成（表1）。

表1 反转录聚合酶链反应引物序列

1.7 统计学方法 用SPSS 17.0 软件对实验结果进行统 计 分 析 ，计 量 资 料 以 均 数 ±标 准 差（）表 示 ，Shapiro-wilk 检验数据正态性，若方差齐、符合正态分布采用独立样本t检验，方差不齐或偏态分布采用Mann.Whitney test 非参数检验法。每组实验重复3 次，检验水准为双侧α=0.05，P＜0.05说明差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMSCs 的培养及多向分化能力鉴定 利用干细胞贴壁生长的特性，可见部分小圆形细胞漂浮于培养基表面，贴壁细胞大小不等，多为短梭形，核椭圆形，有的可呈双核（图1-A）。成骨诱导组细胞周围可见有钙化结节形成，茜素红染色可见红色钙化结节形成（图1-B）。成脂诱导组细胞周围可见大量脂滴形成，油红O 染色低倍镜下观察可见大量红色脂滴形成（图1-C）。软骨诱导液培养3周后，可见有乳白色软骨块形成（图1-D）。

图1 骨髓间充质干细胞形态学观察及三向分化能力。A 为显微镜下BMSCs 形态（50 倍放大）；B 为成骨诱导茜素红染色（50 倍放大）；C 为成脂诱导油红O 染色（50 倍放大）；D 为成软骨诱导形成的软骨块

2.2 大鼠髁突软骨细胞的培养及鉴定 髁突软骨细胞成簇分布，形态多角形，随着细胞数量密集，细胞形态成圆形或多边形，逐渐融合形成“铺路石”样结构（图2-A）。激光共聚焦显微镜下，可见细胞质内II 型胶原呈绿色荧光表达，蓝色为细胞核DAPI染色（图2-B）。

图2 髁突软骨细胞形态学观察及II 型胶原荧光染色。A 为大鼠髁突软骨细胞形态（50 倍放大）；B 为II 型胶原免疫荧光（200倍放大）

2.3 外泌体鉴定 透射电镜下观察BMSCs-外泌体形态和大小（图3 A）：外泌体结构完整，呈圆形囊泡状，伴有“茶托样”特征外形。纳米颗粒追踪分析（图3 B）：所提取的BMSCs-外泌体粒子直径众数87 nm，平均直径100 nm，提示成功提取到BMSC-外泌体。Western blot 检测（图3 C）：外泌体特异性标记蛋白CD9 和TSG101 的表达，但不表达3-磷酸甘油醛脱氢酶。

图3 外泌体的鉴定。A 为透射电镜下观察外泌体结构完整；B为纳米颗粒追踪分析；C为Western blot显示，外泌体表面标志物CD9、TSG101呈阳性表达，但不表达3-磷酸甘油醛脱氢酶

2.4 细胞GAG 含量测定 鲨鱼硫酸软骨素标准溶液的质量浓度X 对其吸光度Y 作线性回归，拟合一标准曲线方程Y=0.01X-0.3814，相关系数R2=0.996 7。结果表明吸光度总变异的99.67%与标准品的浓度有关，具体见图4。根据标准曲线方程计算出细胞内GAG含量，实验组GAG含量在第3天高于对照组［（0.95±0.03）μg/ml 比（0.58±0.02）μg/ml］，差异有统计学意义（t=10.36，P＜0.001）；第7 天实验组高于对照组［（2.68±0.06）μg/ml 比（1.63±0.04）μg/ml］，差异有统计学意义（t=12.01，P＜0.001）；第14 天实验组高于对照组［（3.59±0.07）μg/ml 比（1.86±0.07）μg/ml］，差异有统计学意义（t=10.61，P＜0.001）。

图4 硫酸软骨素标准曲线

2.5 细胞DNA 含量测定 牛胸腺DNA 溶液的质量浓度X 对其吸光度Y 作线性回归，拟合一标准曲线方程Y=1.929 9X-727.77，相关系数R2=0.971 3。结果表明，吸光度总变异的97.13%与标准品的浓度有关，具体见图5。根据标准曲线方程计算出细胞内DNA含量，第3天实验组DNA含量显著高于对照组［（30.14±9.59）μg/ml比（23.45±3.33）μg/ml］，差异有统计学意义（t=3.625，P=0.037）；第7 天实验组与对照组基本一致［（42.82±3.74）μg/ml 比（40.46±7.01）μg/ml］，差异无统计学意义（t=0.447，P＞0.05）；第14 天实验组与对照组基本一致［（54.70±1.36）μg/ml 比（54.70±1.80）μg/ml］，差异无统计学意义（t=0.286，P＞0.05）。

图5 牛胸腺DNA标准曲线

2.6 单位DNA 中GAG 含量测定（GAG/DNA） 第 3 天GAG/DNA 含量实验组高于对照组［（0.0320 ±0.007 1）比（0.023 0±0.003 5）］，差异有统计学意义（t=4.921，P=0.018）；第 7 天实验组高于对照组［（0.063 0±0.006 5）比（0.039 0±0.006 7）］，差异有统计学意义（t=17.78，P＜0.001）；第14 天实验组高于对照组［（0.063 0±0.007 3）比（0.032 0±0.005 8）］，差异有统计学意义（t=15.59，P＜0.001）。结果表明实验组中的外泌体可以促进软骨细胞单位DNA中GAG含量表达。

2.7 RT-PCR 检测细胞中GAG 基因的表达水平 第7 天GAG mRNA 的含量表达水平实验组高于对照组［（2.610±0.018）比（1.000±0.150）］，差异有统计学意义（t=12.31，P＜0.001）；第14天实验组高于对照组［（5.560±0.018）比（2.550±0.090）］，差异有统计学意义（t=14.78，P＜0.001）。结果表明实验组中的外泌体可以促进软骨细胞GAG 基因表达。

3 讨论

干细胞来源的外泌体在各个领域均有应用，作为MSCs分泌物的主要成份，在组织修复中发挥重要作用。目前外泌体的提取方法主要有：超速离心法、密度梯度离心法、聚合沉淀法、超滤法、免疫捕获法等。这些方法均具有含量低或纯度低等缺点，缺乏统一的鉴定标准。提取方法并非本实验的研究重点，因此按照国际细胞外囊泡协会提出方法为指导提取外泌体［18-19］。

蛋白多糖是一类由核心蛋白与GAG 以共价和非共价键所组成的糖复合物，其含糖量可高达95%以上。氨基聚糖通过一个或多个共价键与羧基（-COOH）、硫酸基（-OSO3H）和磺基（-SO3H），重要的GAG 有透明质酸（HA）、硫酸软骨素、硫酸角质酸、硫酸皮肤素、硫酸肝素等［13］。按照蛋白聚糖的组织分布和功能分为3 类：（1）细胞膜PG，各种组织均有表达，与生理功能合病理变化有关；（2）基底膜结合PG，主要在血管上皮细胞基底膜，调节血管分化和调控肿瘤发展有关；（3）细胞外基质PG，主要功能维持细胞外基质结构，最常见的是多聚蛋白聚糖（aggrecan，AG），与HA充填于软骨细胞间隙，是关节软骨主要成份［20］。

通过RT-PCR 检测软骨相关基因的表达水平，GAG 的含量在第7、14 天时，实验组均明显高于对照组，表明BMSCs-外泌体中含有的生物活性因子通过促进GAG 基因的表达。有学者在兔子骨关节病模型中，通过关节腔注射骨髓间充质干细来源的外泌体联合HA，术后进行组织学和免疫组化分析，发现外泌体可以促进蛋白聚糖的合成进而加快软骨损伤的修复，并且新形成的软骨组织与天然软骨具有相近的机械性能［21］。

为了进一步检测软骨细胞中GAG 含量的表达情况，我们通过分析细胞内的蛋白多糖含量，实验组第3、7、14 天均明显高于对照组，说明BMSCs-外泌体促进蛋白多糖表达，这些结果与上述RT-PCR 结果一致。为了排除细胞数量增加的干扰，我们检测单位DNA 中GAG 含量表达的变化，结果显示第7、14 天时实验组GAG/DNA 含量明显高于对照组。所有的这些证实了BMSCs-外泌体促进软骨细胞GAG含量的表达，对维持软骨的表型发挥重要的作用。这与Zhang 等［22］将 MSCs 来源的外泌体与软骨共培养，促进软骨基质合成，植入动物缺损模型后促进软骨缺损愈合结果一致。有学者发现外泌体中的一些miRNA 可以调控软骨基质合成，比如 miR-125b 和 miR-320 通过下调 aggrecanse 和MMP-13 表达，从 而 减 轻 ECM 破坏，miR-92a 可以通过PI3K/AKT/mTOR 通路靶向noggin 3 上调软骨基质合成，介导MSC外泌体促进软骨修复［23-24］。

综上所述，干细胞来源的外泌体增加单位DNA 中GAG含量表达，有助于增加髁突软骨细胞的蛋白多糖表达，这将为颞下颌骨关节病的治疗开辟新的思路。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。