朱钟钟 姜进平 黄耿 罗海平 汤守元

1鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院胃肠肛肠外科，黄石 435000；2鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院泌尿外科，黄石 435000

胃癌是最常见的恶性消化系统肿瘤，其发病率呈逐年增加的趋势［1］。胃癌易转移且其早期症状不明显，大部分患者临床确诊时已在中晚期，治疗效果有限，5 年生存率很低［2］。由此，探究胃癌的分子治疗靶点和诊断标志物是胃癌研究领域的热点。微小RNA（microRNA，miRNA）由前体pre-microRNA 经过剪切生成，起初被认为不具有特定生物学功能，是基因转录过程的副产物［3］。越来越多研究表明，miRNA 与肿瘤的产生、进展、转归显著相关［4-5］。微小RNA-1322（miR-1322）被证实在多种肿瘤（如肝癌、食管鳞癌、肺腺癌等）组织或细胞株中低表达，以不同的作用机制抑制癌症的发生和进展，可能与癌症患者的预后相关［6-7］。miR-1322 在 胃 癌 中 鲜 有 报 道 ，于 2020 年 8 月 至 2021 年6 月，本研究通过慢病毒感染上调SGC7901 细胞miR-1322 的表达，观察其对胃癌SGC7901 细胞迁移及凋亡的影响，探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂 胃癌SGC7901 细胞购于中国科学院上海细胞所；DMEM 培养基和胰蛋白酶购于美国Gibco 公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega 公司；Transwell 小室购自美国康宁公司；慢病毒（GV112）购于上海吉凯生物科技有限公司；实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒购于日本TaKaRa公司；细胞凋亡试剂盒购于北京索莱宝生物科技有限公司；Transwell 小室购于美国Corning 公司；一抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白3（caspase 3）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白8（caspase 8）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、β-连环蛋白（β-catenin）、瞬时受体电位香草酸4（TRPV4）和辣根过氧化物酶标志的二抗购于美国CST公司。

1.2 细胞培养和感染 SGC7901 细胞接种在含10%胎牛血清DMEM 培养基，在37 ℃恒温培养箱（5%CO2）中培养。将SGC7901 细胞接种在六孔板，根据慢病毒感染说明书（感染复数为20），细胞汇合度为60%时感染，分为2 组：对照组感染空白慢病毒，miR-1322 组感染miR-1322 慢病毒载体。感染8 h后更换新的培养基，采用嘌呤霉素筛选稳定感染的SGC7901细胞株。

1.3 生物信息学预测miR-1322 的靶基因 用PicTar（https：//pictar.mdc-berlin.de/）预测 miR-1322 的靶基因，TRPV4可能是miR-1322的靶基因。

1.4 qRT-PCR 检 测 miR-1322 和 TRPV4 mRNA 的 表达 待感染后的SGC7901 细胞汇合度达70%，TRIzol 法提取SGC7901 细胞株总RNA。定量RNA 纯度和浓度，逆转录RNA 为cDNA。测定miR-1322相对表达以U6为内参，测定TRPV4 mRNA 相对表达以GAPDH 为内参，进行qRT-PCR扩增，运用2-ΔΔCt方法计算结果。引物序列如下，miR-1322 正向引物：5’-GATGATGCTGCTGATGCTG-3’，反 向 引 物 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；TRPV4 正向引物：5’-CTACGGCACCTATCGTCACC-3’，反向引物5’-TTAGGCGTTTCTTGTGGGTCA-3’。

1.5 流式细胞术检测SGC7901 细胞的凋亡 收集胰蛋白酶消化的SGC7901 细胞，使用重悬2 组细胞，分别加入Annexin V-FITC 试剂和PI 染液，充分混合均匀，在4 ℃下避光放置35 min。加入Annexin V-FITC 结合液，使用流式细胞仪检测SGC7901细胞凋亡的情况。

1.6 Transwell 实验检测SGC7901 细胞的迁移能力将2 组SGC7901 细胞进行饥饿处理，收集胰蛋白酶消化的SGC7901 细胞，将200 μl 无血清细胞悬液接种于Transwell小室上室，将700 μl完全培养基加至Transwell小室下室，恒温培养箱培养30 h。通过4%多聚甲醛固定SGC7901细胞，通过结晶紫染液染色SGC7901 细胞。通过PBS 溶液充分洗涤，在100倍倒置显微镜下拍照。

1.7 Western blot 检测TRPV4 基因蛋白表达 提取2 组 SGC7901 细胞总蛋白并测蛋白浓度，每孔加入 40 μg 蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5 h，聚偏二氟乙烯膜转膜2.0 h。9%脱脂牛奶封闭1.5 h。根据不同蛋白分子量裁剪条带，于一抗中保存过夜。于辣根过氧化物酶标志的二抗中保存3.5 h。根据1∶1 比例制备ECL 发光液，在曝光仪内曝光、显影和拍照。

1.8 统计学分析 采用SPSS 22.0 统计软件统计实验数据，符合正态分布的计量资料均以均数±标准差（）表示，每个实验均重复3 次，两组比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-1322 在SGC7901 细胞中的过表达情况 对照组和miR-1322 组miR-1322 的表达分别为（1.01±0.07）和（12.96±1.05），miR-1322 组 miR-1322 表 达 是 对 照组 的12.83 倍（t=6.30，P＜0.01），提示感染miR-1322 慢病毒载体成功。

2.2 过表达miR-1322 促进SGC7901 细胞的凋亡 细胞凋亡结果显示（图1），对照组和miR-1322 组SGC7901 细胞凋亡比例分别为（6.95±1.02）%和（32.88±6.22）%。与对照组相比，miR-1322组SGC7901细胞凋亡比例明显增加（t=4.11，P＜0.01），说明过表达miR-1322后SGC7901细胞凋亡增加。

图1 过表达miR-1322对SGC7901细胞凋亡的影响（A为对照组，感染空白慢病毒载体；B为miR-1322组，感染胃癌SGC7901细胞）

2.3 过表达miR-1322 抑制SGC7901 细胞的迁移 如图2，对照组和miR-1322 组SGC7901 细胞迁移数分别为（107.30±10.94）个和（43.44±8.04）个。与对照组相比，miR-1322 组 SGC7901 细胞迁移数显著降低（t=4.28，P＜0.01），说明过表达miR-1322后SGC7901细胞迁移减少。

图2 过表达miR-1322对SGC7901细胞迁移的影响（A为对照组，感染空白慢病毒载体；B为miR-1322组，感染胃癌SGC7901细胞）

2.4 生物信息学预测miR-1322 的靶基因 用PicTar软件预测 miR-1322 的靶基因，TRPV4 可能是 miR-1322 的靶基因，miR-1322与TRPV4基因的结合位点见图3。

图3 miR-1322与TRPV4基因的互补结合位点

2.5 过表达miR-1322 抑制SGC7901 细胞中TRPV4 mRNA 表达 对照组和 miR-1322 组 SGC7901 细胞中TRPV4 mRNA 的表达分别为（1.01±0.09）和（0.26±0.03），与对照组相比，miR-1322组SGC7901细胞TRPV4 mRNA 表达降低（P＜0.01），说明 miR-1322 负调控 TRPV4 mRNA 的表达。

2.6 TRPV4 蛋白和凋亡及迁移相关蛋白的表达Western blot 结果表明（图 4），miR-1322 组 SGC7901 细胞TRPV4 蛋白表达显著下调，细胞凋亡蛋白caspase 3、caspase 8表达增加，细胞迁移蛋白β-catenin表达降低。

图4 miR-1322对TRPV4蛋白和凋亡、迁移相关蛋白表达的影响

3 讨 论

越来越多的miRNA 被发现与胃癌细胞的恶性行为密切相关［8-9］。如miR-146b-5p 在胃癌组织中表达明显低于癌旁组织，在合并淋巴转移和远处转移的胃癌患者中可见更低水平的miR-146b-5p，体外过表达miR-146b-5p 减弱了胃癌细胞的增殖和迁移潜能［10］。Shi等［11］研究发现，外泌体源性的miR-1246 在胃癌患者和健康对照人群血清中差异有统计学意义，miR-1246 可能成为胃癌早期诊断的生物标志物。miR-1322 是一种新发现的miRNA，不具有编码蛋白的功能［6］。Zhao 等［7］研究发现，miR-1322 能够抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，同时促进肝癌细胞的凋亡。Wu等［6］研究发现，miR-1322通过诱导自噬，增强埃克替尼耐药的肺腺癌细胞对埃克替尼的敏感性。miR-1322 在胃癌细胞中的作用机制并不清楚，其可能作为抑癌因素参与胃癌的进展。本研究发现，上调SGC7901细胞中miR-1322表达后，SGC7901 细胞凋亡比例增加，细胞迁移能力明显减弱，提示miR-1322在胃癌中是一种抑癌因素。

miRNA 主要通过以序列不完全或完全互补与靶基因mRNA3’非翻译区相互结合，促进靶基因mRNA 的分解，阻滞靶基因 mRNA 的翻译［12-13］。为了探究 miR-1322 在胃癌中的作用机制，本研究用PicTar 软件预测miR-1322 的靶基因，TRPV4可能是miR-1322的靶基因。TRPV4蛋白是一种通道蛋白，包括 871 个氨基酸［14］。TRPV4 蛋白在多数肿瘤组织或细胞中表达上调，其通过抑制凋亡蛋白表达从而抑制细胞凋亡的发生，同时TRPV4 蛋白可通过降低细胞的刚度促进细胞的迁移［15-16］。TRPV4 蛋白在胃癌组织中表达升高，参与促进胃癌的进展［17］。qRT-PCR 和Western blot结果表明，上调miR-1322的表达后，TRPV4基因表达显著下降，表明TRPV4 mRNA 翻译过程被抑制。本研究进一步发现，miR-1322组SGC7901细胞TRPV4蛋白表达降低后，细胞凋亡蛋白caspase 3、caspase 8 表达增加，细胞迁移蛋白β-catenin 表达降低。TRPV4 基因表达改变可能是对照组和miR-1322组细胞凋亡和迁移能力差异的关键。

综上所述，上调miR-1322 可促进胃癌SGC7901 细胞的凋亡，抑制细胞的迁移能力，其机制可能与TRPV4基因表达改变有关。miR-1322 对胃癌的发生发展有抑制作用，可能成为胃癌治疗的分子靶点。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。