戴嘉婧 韩馨乐 钟福波 林哲广 江淑琪 韦伟 方征宇

据2018年全球癌症数据统计，乳腺癌仍然是女性最常见的癌症，也是女性患癌导致死亡的主要原因，2018年约有209万新发诊断的乳腺癌病例和63万的乳腺癌死亡病例，分别占女性癌症总发病率的24.2%和女性癌症死亡率的15%[1]。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)因免疫组化特征缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及表皮生长因子受体2(HER2)而得名，占所有乳腺癌的15%～20%[2]。TNBC侵袭性高，复发率高，对内分泌治疗反应不敏感，缺乏有效个体化治疗方案。有研究发现，年龄作为评价TNBC预后的独立危险因素，因TNBC的高异质性而呈现出手术后年龄越小，预后越差的临床特征[3]。随着非编码RNA研究的深入，越来越多的非编码RNA因为其与TNBC的密切相关性而有成为潜在靶点的可能性。最近几年，关于环状RNA(circRNA)异常与TNBC相关性的研究和报道迅速增加。本文对TNBC和circRNA相关内容进行综述。

一、TNBC的分子靶点研究进展

分子靶点的确定是研发治疗TNBC药物的基础，目前针对TNBC分子靶点的研究主要围绕乳腺癌发生发展的易感基因及其表达产物、信号通路相关的转录因子、非编码RNA等。首先，基因组学、转录组学及蛋白质组学的研究在不断扩大我们对TNBC生物异质性和复杂性的认识。例如，核受体家族的雄激素受体(androgen receptor,AR)在TNBC中的表达率约为20.7%，其作用于靶基因在乳腺癌的发生发展中扮演着重要角色，AR阳性的TNBC病人有更好的总生存率，提示AR有成为TNBC新的预后指标的可能性[4]。其次，FDA批准的治疗方案包括针对BRCA基因突变和表达PD-L1的TNBC病人分别使用PARP抑制剂(poly-ADP-ribose polymerase)和阿特珠单抗联合紫杉醇治疗[5]。其他常见分子靶点包括EGFR、VEGFR/VEGFR、PI3K/mTOR等，然而这些都是在肿瘤治疗中广泛应用的分子靶点，特异性不高。值得一提的是，有研究发现TNBC信号通路下游的核心转录调控分子TAZ和YAP的表达与TNBC肿瘤大小、分级呈正相关，且在促肿瘤发生方面二者具有协同作用[6]，提示其潜在应用性。

近年来，随着非编码RNA研究的广泛深入，与TNBC发生发展相关的非编码RNA研究也不断见于报道。其中，很多微小RNA(microRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA)都与TNBC发展密切相关而且可作为分子治疗的靶点[7-9]。circRNA作为一类特殊的非编码RNA，也已有不少报道与TNBC的发生发展密切有关。

二.circRNA及其在肿瘤发生发展的作用

circRNA是非编码RNA家族中最晚发现的RNA，通常是由蛋白质编码外显子的反向剪接产生的，其特征是存在通过反向剪接连接3'和5'末端的共价键，如由内含子反向重复序列如Alu元件或RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)如QKI蛋白介导的反向剪接机制生成了circRNA[10]。circRNA具有共价闭合环形结构且无5'端帽子结构和3'端多聚A尾结构，这使circRNA能耐受核酸外切酶的消化而保持相对稳定[11]。circRNA在组织和发育的特定阶段中差异性表达，并且显示出跨物种的保守性。

据文献报道，在肿瘤发生发展过程中，circRNA主要是通过影响肿瘤细胞的增殖、上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等过程调控肿瘤细胞的生物学行为[12]。具体来说，circRNA可通过影响MAPK/ERK通路、PI3K/AKT通路或影响周期调控点等来调控肿瘤细胞增殖。例如在PI3K/AKT通路中，配体与受体酪氨酸激酶结合，激活PIK3进而使AKT磷酸化促进细胞增殖，在这一过程中，CDR1as和circNT5E通过促进PIK3的表达来调控肝癌细胞的增殖进程[13]。

三、TNBC病人癌与癌旁组织中差异表达的circRNA

1表达上调的17个circRNA ：高通量测序技术的发展使得TNBC中的大量异常表达的circRNA被发现。与正常癌旁组织相比，表达上调的circRNA有circGFRA1、circEPSTI1、circUBAP2、circANKS1B、circPLK1、circKIF4A、circTFCP2L1、circAGFG1、circRNA_069718、circRAD18、hsa_circ_0091074、circGNB1、circIFI30、circSEPT9、hsa_circ_0005320、hsa_circ_0058514、ciRS-7。其中，ciRS-7作为最早被发现的circRNA，广泛地在各种不同肿瘤中发挥作用，如ciRS-7高表达可以促进乳头状甲状腺癌的增殖[14]，且高表达ciRS-7宫颈癌病人其肿瘤浸润程度和淋巴结转移可能性都更高；孟令娇等[15]研究表明，在TNBC病人中，ciRS-7的高表达也与肿瘤浸润和淋巴结转移明显相关，但ciRS-7在TNBC中是通过何种下游分子靶点发挥作用有待进一步实验证实。

2.表达下调的4个circRNA ：与正常癌旁组织相比，TNBC中表达下调的circRNA有circITCH、circAHNAK1、circTADA2A-E5 / E6、circFBXW7。其中，circITCH作为肿瘤抑制因子在其他的肿瘤中的表达水平也显著下调，如结直肠癌、神经胶质瘤、肺癌[16]。而circFBXW7通过编码蛋白质来抑制TNBC细胞的增殖和迁移能力[17]。

四.circRNA调控TNBC发展的不同分子机制

1.circRNA主要通过miRNA海绵作用在TNBC中调控下游靶基因：其中 ，与表达上调的circRNA结合的miRNA在TNBC中的表达水平都为下调，相反，与表达下调的circRNA结合的miRNA在TNBC中的表达水平都为上调，即miR-214、miR-17、miR-421、miR-203a-3p、miR-197-3p在TNBC中为促肿瘤因子，而与TNBC中表达上调的circRNA所结合的miRNA为TNBC中的抑癌因子。值得注意的是，miR-7在很多其他研究中证明不只可以结合circRNA，如第一个被发现的ciRS-7,还可以结合其他非编码RNA如长非编码RNA LINC00115进而促进乳腺癌的转移[18]。尽管hsa_circ_0005320、hsa_circ_0058514、ciRS-7都有实验证明其高水平可以促进TNBC的增殖等肿瘤生长效应，但其机制是否是通过结合miRNA分子有待进一步实验证实。

2.circRNA直接翻译蛋白质调控TNBC：FBXW7-185aa被证实有抑制神经胶质瘤细胞增殖和迁移的功能，随后研究发现circFBXW7编码的FBXW7-185aa蛋白也可以有效地抑制TNBC的发展[17]。通过荧光素酶报告基因实验和RNA免疫沉淀实验显示，circFBXW7不仅可以充当miR-197-3p的海绵进而上调FBXW7表达来抑制TNBC的生长和转移，其编码的FBXW7-185aa蛋白通过增加FBXW7的丰度并诱导c-myc降解也可以抑制TNBC细胞的增殖和迁移能力[17]。

3.circRNA间接调控其亲本基因或非亲本基因 ：目前报道的circRNA中有5个通过结合miRNA后调控的下游靶基因为该circRNA的亲本基因。circGFRA1可通过结合miR-34a来调控其亲本基因GFRA1促进TNBC的细胞增殖[19]；circITCH是通过结合miR-214和miR-17来调控其亲本基因ITCH的表达[16]；circKIF4A发挥miRNA海绵功能结合miR-375来调控其亲本基因的KIF4A的表达[20]；circPLK1发挥miRNA海绵功能结合miR-296-5p来调控其亲本基因的PLK1的表达[21]；circFBXW7结合miR-197-3p来上调其亲本基因FBXW7的表达[17]。

受到circRNA间接调控的非亲本基因中，circIFI30通过circIFI30-miR-520b-3p-CD44轴调节CD44，在乳腺癌细胞中，CD44的丢失会导致肿瘤形成延迟[22]。因此，circIFI30激活CD44的表达进一步促进TNBC的进展。circAGFG1通过circAGFG1-miR-195-5p-CCNE1轴调节靶基因CCNE1，研究证实circAGFG1的过表达会增加其靶基因CCNE1的mRNA和蛋白质水平，而CCNE1为细胞周期蛋白E基因，研究发现其与肿瘤如子宫内膜癌的发生密切相关[23]，因此该轴的激活与促进TNBC细胞增殖有关。

4.circRNA参与调控肿瘤相关信号通路：据文献报道，TNBC相关的circRNA参与调控的信号通路有经典Wnt/β-catenin通路、LIF/Stat3通路等。其中，低表达的circITCH通过circITCH-miR-214/17-ITCH轴激活其亲本基因ITCH，而ITCH是Nedd4样E3家族的一部分，它可以降解磷酸化后的无序结构，从而使得经典的Wnt信号通过失活[16]。而circTADA2A-E6可能参与调控了PI3K-AKT和mTOR信号通路[24]，但研究只是通过敲低或过表达circTADA2A-E6引起的细胞功能改变作以推测，具体是否引起该信号通路相关分子水平的变化需进一步实验证实。

EMT受到信号通路的精确调控以确保不同分化的细胞在正确的时间内正确定位，在癌症发生的在早期如果EMT激活不当，就会导致癌细胞发生迁移和侵袭。EMT主要由TGF-β家族配体诱导，它刺激R-SMADs和co-SMADs的磷酸化和核易位以激活SNAI，bHLH和ZEB转录因子[25]。在TNBC中，circANKS1B通过海绵作用结合miR-148a-3p和miR-152-3p的作用，增加转录因子USF1的表达，并上调TGF-1的表达，从而激活TGF-1/Smad信号通路来促进EMT的发生[26]。

五、circRNA有望作为分子标志物辅助诊断和治疗TNBC

研究发现，血液或唾液中的外泌体可以分泌出circRNA，因其具有共价闭合结构不易被核酸外切酶消化，表达水平保持相对稳定。因此circRNA可以作为生物标志物，对诊断包括肿瘤在内的很多疾病有重要的意义[27]。同时，血液或唾液中的circRNA相较易降解的miRNA更适合作为分子标志物监控TNBC的肿瘤负荷。例如有研究报道，血浆外泌体中高表达的circPDE8A与胰腺导管癌病人的生存及预后呈负相关，而通过血液外泌体可以检测到病人circPDE8A的表达量[28]。而关于TNBC病人血液外泌体中circRNA的研究，目前只有肿瘤抑制因子circFBXW7可以在外泌体中被检测到的相关报道[17]。

在治疗方面，有研究指出细胞外囊泡作为生物分子的内源性载体，参与到细胞间物质的运输及信息的交换，细胞外囊泡有可能将抑癌circRNA作为血液中循环生物标志物，准确地传递到作用位点，因此抑癌circRNA可能将作为工具在临床上用于TNBC的治疗[29]。