江石平，朱婉萍

(浙江省中医药研究院，浙江 杭州 310007)

低共熔溶剂是一种新型溶剂，它是由某些固体有机分子与特定的离子型化合物按照一定比例混合，在室温下呈液体状态的低共熔混合物[1]，具有低熔点、低成本、低毒性、易制备、能再生、可生物降解等优点[2]。现代研究表明，低共熔溶剂能显著提高多酚、黄酮、多糖等成分的提取率[3-4]，是提取中药活性成分的理想溶剂。

南方红豆杉Taxuschinensisvar.mairei是国内特有的红豆杉科红豆杉属植物[5]，其叶中成分主要为紫杉萜、黄酮、多糖、生物碱、挥发油等[6]，其中黄酮具有抗癌、抗肝脏毒性、抗菌、抗氧化等多种药理作用[7]。目前，中药中黄酮类成分的提取溶剂主要是水和有机溶剂[8]，但均存在能耗高、制备周期长、提取率低、不够环保等缺点，故寻找绿色溶剂具有重要意义。本实验采用超声辅助提取技术，研究不同低共熔溶剂对总黄酮提取率的影响，并利用响应面对工艺进行优化，以期为该成分开发利用提供参考依据。

1 材料

紫外-可见光分光光度计(型号UV-1800,日本岛津公司)；电子分析天平(型号Sartorius BS224S，德国赛多利斯公司)；超声清洗器(型号KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司)；磁力搅拌器(型号90-2，常州越新仪器制造有限公司)。

氯化胆碱[阿拉丁试剂(上海)有限公司，批号B1920039]；1,4-丁二醇(批号B1807141)、丙三醇(批号170315)、1,3-丁二醇(批号D1726006)、乙二醇(批号20170425)(西陇科学股份有限公司)；硝酸铝(美国Mackin公司，批号C10373927)；亚硝酸钠(批号20140107)、氢氧化钠(批号20121114)(国药集团化学试剂有限公司)。芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号100080-201409)。红豆杉叶购于宁波泰康红豆杉生物科技有限公司，经浙江省中医药研究院药用资源研究中心浦锦宝研究员鉴定为南方红豆杉Taxuschinensisvar.mairei枝叶。超纯水为自制。

2 方法与结果

2.1 低共熔溶剂制备 按照1∶1∶1摩尔比精密称取氯化胆碱-(1,4-丁二醇)-水、氯化胆碱-丙三醇-水、氯化胆碱-乙二醇-水、氯化胆碱-(1,3-丁二醇)-水适量，置于烧杯中，在85 ℃下磁力搅拌器充分搅拌至产生均匀剔透的液体为止，冷却至室温，即得。

2.2 线性关系考察 参考文献[8]报道，精密称取芦丁对照品5 mg，置于25 mL量瓶中，65%乙醇定容至刻度，超声溶解，配制0.2 mg/mL母液，分别精密吸取5、4、3、2、1、0 mL至10 mL量瓶中，65%乙醇定容至5 mL，摇匀，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入4%氢氧化钠溶液4 mL，65%乙醇定容，摇匀，放置15 min。采用紫外-可见光分光光度计测定芦丁在200～800 nm波长处的吸光度，发现该成分在508 nm处有最大吸收。以芦丁质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)进行回归，得到方程为A=11.958X+0.019(R2=0.999 3)，在0.019～0.096 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.3 供试品溶液制备 取红豆杉叶末约0.1 g，精密称定，加入一定体积不同体积分数(0、12.5%、25%、75%、100%)的低共熔溶剂水溶液，在一定温度下超声提取一段时间，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，精密量取0.2 mL，置于10 mL量瓶中，65%乙醇定容5 mL，摇匀，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入4%氢氧化钠溶液4 mL，再以65%乙醇定容，摇匀，放置15 min，测定吸光度，计算总黄酮提取率，公式为提取率=[(C×V/0.2×N)/M]×100%，其中C为总黄酮质量浓度，V为样品溶液体积，N为稀释倍数(10倍)，M为样品质量。

2.4 单因素试验

2.4.1 低共熔溶剂种类 考察氯化胆碱-(1,4-丁二醇)-水、氯化胆碱-丙三醇-水、氯化胆碱-乙二醇-水、氯化胆碱-(1,3-丁二醇)-水对总黄酮提取率的影响，结果见图1。由此可知，4种低共熔溶剂的提取率均高于65%乙醇提取，以氯化胆碱-乙二醇-水更明显，故选择其作为提取溶剂。

注：DES-1为氯化胆碱-乙二醇-水，DES-2为氯化胆碱-丙三醇-水，DES-3为氯化胆碱-(1,4-丁二醇)-水，DES-4为氯化胆碱-(1,3-丁二醇)-水。图1 低共熔溶剂种类对总黄酮提取率的影响

2.4.2 低共熔溶剂体积分数 考察0、12.5%、25%、75%、100%对总黄酮提取率的影响，结果见图2。由此可知，在75%时总黄酮提取率最高，故选择其作为低共熔溶剂体积分数。

图2 低共熔溶剂体积分数对总黄酮提取率的影响

2.4.3 液料比 考察10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1对总黄酮提取率的影响，结果见图3。由此可知，总黄酮提取率随着液料比增加先显著升高，后略有降低，在30∶1时最高，故选择其作为液料比。

图3 液料比对总黄酮提取率的影响

2.4.4 提取时间 考察30、40、50、60、70 min对总黄酮提取率的影响，结果见图4。由此可知，提取60 min时提取率最高，故选择其作为提取时间。

图4 提取时间对总黄酮提取率的影响

2.4.5 提取温度 考察30、40、50、60、70 ℃对总黄酮提取率的影响，结果见图5。由此可知，提取率随着提取温度增加先升后降，在60 ℃时最高，故选择其作为提取温度。

图5 提取温度对总黄酮提取率的影响

2.5 响应面试验 依据单因素试验结果，选择对总黄酮提取率影响较大的低共熔溶剂体积分数(A)、液料比(B)、提取时间(C)作为影响因素，总黄酮提取率作为评价指标(Y)，依据Box-Behnken设计原理进行3因素3水平试验，共17组，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平

表2 试验设计与结果

通过Design Expert 8.0.6软件进行多元回归拟合，得方程为Y=65.45-1.80A-1.26B+0.96C+0.35AB-0.79AC-0.64BC-8.01A2-1.83B2-3.83C2，方差分析见表3。由此可知，模型P<0.01，具有显著性差异；失拟项P>0.05，表明模型失拟度不显著，结果准确可靠；相关系数R2为0.980 8，表明可用该方程解释98.08%的数据；因素A、B、C、A2、B2、C2对总黄酮提取率均有显著影响(P<0.05，P<0.01)，影响程度依次为A>B>C。

表3 方差分析

响应面分析[9]见图6。由此可知，随着液料比、低共熔溶剂体积分数增加，总黄酮提取率先升后降，低共熔溶剂体积分数的变化曲面比液料比陡峭，等高线沿前者方向的变化相对密集，表明它对响应值峰值的影响更大；低共熔溶剂体积分数的变化曲面比提取时间陡峭，表明前者对响应值峰值的影响大于后者；液料比、提取时间的变化曲面坡度相差不大，两者交互作用不明显。

图6 各因素响应面图

2.6 验证试验 根据Design Expert 8.0.6软件，得到最优工艺为低共熔溶剂体积分数72.13%，液料比27.22∶1，提取时间51.37 min，总黄酮提取率为6.711%，为了后续实验方便操作，将其修正为低共熔溶剂体积分数72%，液料比27∶1，提取时间51 min。在此优化工艺下进行3批验证试验，测得总黄酮平均提取率为6.703%，与预测值6.711%接近，表明该工艺稳定可靠。

3 讨论

文献[10]报道，提取红豆杉总黄酮最佳提取溶剂为65%乙醇；本实验发现，与65%乙醇提取比较，4种低共熔溶剂的提取率分别高出23.17%、16.34%、19.07%、17.76%，表明低共熔溶剂可显著提高总黄酮提取率，其原因可能是它对植物细胞壁有较强的破坏作用[11]，并且具有一定黏度，有利于红豆杉叶粉末悬浮分散在溶剂中，增大接触面积，从而更有利于黄酮流出。结果表明，低共熔溶剂种类不同，提取率升高程度有所差异，以丙二醇最明显，推测可能是其本身溶解性、黏性、导电性等物理性质的差异所致。

另外，低共熔溶剂体积分数对总黄酮提取率也有显著影响，其较高时溶液比较黏稠，不利于进入红豆杉叶基质内部，导致提取率下降；当加入一定量水后，可显著降低黏度，使其更好地渗入到基质内部，破坏细胞壁，促进黄酮流出，但含水量过高时会破坏醇羟基与氯化胆碱之间的氢键，减少低共熔溶剂与黄酮之间的相互作用[12]，导致提取率下降。

综上所述，本实验在单因素试验基础上采用响应面法优化超声辅助低共熔溶剂提取红豆杉叶总黄酮工艺，发现该方法优于传统有机溶剂提取工艺，可为该成分开发利用提供参考。