魏永鸽，黄贺梅，徐 凯，孙永武，李姝颖，范明松

(1.郑州铁路职业技术学院，河南 郑州 450052；2.黄河科技学院，河南 郑州 450005；3.上海雷允上药业有限公司技术中心，上海 201401)

二氢杨梅素是从蛇葡萄科葡萄属AmpelopsisMichx植物中提取分离出来的二氢黄酮醇类化合物，具有降血脂、抗炎、抗肿瘤、降血压、预防心脑血管疾病等多种药理作用[1-4]，但该成分水溶性差，导致溶出受限；脂溶性较低[4]，导致透膜吸收困难，故其口服生物利用度很低[5]。为了改善上述问题，已有关于二氢杨梅素制剂新技术的报道，如自微乳、脂质体、微囊等[6-8]，但制备工艺复杂。

磷脂复合物是在非质子溶剂中药物分子和磷脂(或磷脂酰胆碱)通过分子间作用力结合在一起[9-10]，对药物脂溶性改善作用较大，但分散性差，溶出困难[11]。滴丸是通过将基质加热熔融后加入药物进而形成均一溶液，滴入冷凝液而形成的丸剂，具有制备过程简单、工业化程度高、质量易控制等优势，可加快药物溶出，提高生物利用度[12]。本实验首先制备二氢杨梅素磷脂复合物，并考察其存在状态、溶解度等基本情况，再将其进一步制成滴丸，以期为相关制剂开发提供研究策略和参考资料。

1 材料

1.1 仪器 MSE125P-CE型电子天平(德国Sartorius公司)；R2000型旋转蒸发仪(艾卡仪器设备有限公司)；Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司，配置DAD检测器、自动进样器)；D-QCGY-12型氮吹仪(上海助乘实业有限公司)；D-8型X射线粉末衍射仪(德国Bruker公司)；DWJ-2000S-D型滴丸机(烟台康达尔药业有限公司)；RC-6D型智能药物溶出试验仪(天津创兴电子设备制造有限公司)；2401PC型可见分光光度仪(日本岛津公司)。

1.2 试剂、药物与动物 二氢杨梅素对照品(批号P20151015，质量分数为99.1%，上海爱启医药科技技术有限公司)。卵磷脂(批号181010，磷脂酰胆碱质量分数>98%，上海辅必成医药科技有限公司)；PEG 6000(批号190515，国药集团化学试剂有限公司)。四氢呋喃(色谱纯，批号C10303495)、磷酸(批号P816338-1L)(上海麦克林生化科技有限公司)。SD大鼠购自河南省动物实验中心，动物生产许可证号SCXK(豫)2016-0001，实验室饲养1周，选择体质量(300±20)g者进行药动学实验。

2 方法与结果

2.1 二氢杨梅素含量测定

2.1.1 色谱条件 Waters C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.1%磷酸(40∶60)；体积流量1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长291 nm；进样量20 μL。理论塔板数以二氢杨梅素计，不低于8 500。

2.1.2 线性关系考察 称取二氢杨梅素对照品20 mg，溶于10 mL乙腈，作为2.0 mg/mL贮备液，流动相逐步稀释成1.0、5.0、10.0，20.0、40.0、50.0 μg/mL的对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以二氢杨梅素质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=0.912 7X+2.697 8(r=0.999 9)，在1.0～50.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液制备 取磷脂复合物滴丸10粒，置于100 mL量瓶中，加入约80 mL 85%乙醇超声溶解并定容至刻度，精密量取0.5 mL至10 mL量瓶中，流动相稀释定容至刻度，即得。

2.1.4 方法学考察 取50.0 μg/mL(高)、20.0 μg/mL(中)、1.0 μg/mL(低)对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得日内精密度RSD分别为0.08%、0.11%、0.14%，表明仪器精密度良好。取“2.1.3”项下供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得二氢杨梅素峰面积RSD为0.53%，表明溶液在24 h内稳定性良好。按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得二氢杨梅素峰面积RSD为1.07%，表明该方法重复性良好。取磷脂复合物滴丸10粒，置于100 mL量瓶中，平行9份，分别加入对照品12、24、36 mg各3份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得二氢杨梅素平均加样回收率分别为99.42%、100.17%、99.42%，RSD分别为0.98%、0.67%、1.13%。

2.2 磷脂复合物制备 按文献[7]报道的方法，称取二氢杨梅素50 mg、大豆磷脂120 mg(摩尔比1∶1)，置于三角烧瓶中，加入45 mL四氢呋喃制得混悬液，45 ℃水浴磁力搅拌一定时间至溶液澄清，在45 ℃下减压旋蒸除去有机溶剂，即得，密封后置于干燥器中。平行制备3批样品，按文献[7]报道的方法，测得其平均复合率为99.47%。

2.3 磷脂复合物表征

2.3.1 紫外吸收光谱 取二氢杨梅素、磷脂复合物适量，加入甲醇溶解，再以甲醇为空白，在190～400 nm波长处进行扫描，结果见图1。由此可知，两者特征吸收峰完全一致，表明二氢杨梅素结构中的生色基团未发生变化，与文献[10]报道的磷脂复合物紫外吸收光谱与原料药相比未发生变化一致。

图1 各样品紫外吸收图谱Fig.1 Ultraviolet absorption spectra of various samples

2.3.2 晶型 通过X射线粉末衍射(XRPD)对二氢杨梅素、物理混合物、磷脂复合物进行扫描，采用Cu-Kα靶，扫描速度为8°/min，扫描范围(2θ)为3°～45°，结果见图2。由此可知，二氢杨梅素图谱中在9°～ 29°范围内出现多处晶型峰；物理混合物图谱中仍可明显观察到二氢杨梅素晶型峰；磷脂复合物图谱中二氢杨梅素的典型晶型峰全部消失，表明该成分以无定型状态存在。

图2 各样品XRPD图谱Fig.2 XRPD patterns for various samples

2.3.3 表观溶解度 取二氢杨梅素、物理混合物、磷脂复合物适量，加入正辛醇或蒸馏水，25 ℃、800 r/min搅拌48 h，取混悬液，8 000 r/min离心15 min，取上清液，测定表观溶解度，结果见表1。由此可知，与二氢杨梅素比较，磷脂复合物在正辛醇的表观溶解度提高1.41倍，具有显著差异(P<0.01)，由微溶改善至略溶；在水中的表观溶解度提高1.59倍，也具有显著差异(P<0.01)，但仍属于几乎不溶。由于磷脂复合物黏性较大，不利于药物溶出，故需要联合其他制剂技术加以改善。

表1 二氢杨梅素表观溶解度测定结果Tab.1 Results of apparent solubility determination of dihydromyricetin (μg/mL,

2.4 滴丸制备 以圆整度为指标，本实验考察了基质种类(PEG 4000、PEG 6000及两者等量混合物)、磷脂复合物与基质比例(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、滴距(5、8、10 cm)、滴速(45、50、55滴/min)，最终选择PEG 6000作为基质，磷脂复合物与基质比例为1∶4，滴距为8 cm，滴速为50滴/min。滴丸制备工艺为取20 g PEG 6000至烧杯中，75 ℃水浴加热熔融，边搅拌边加入5 g磷脂复合物，继续搅拌0.5 h至完全混匀，立即倒入贮液槽内(恒温75 ℃)，滴头型号3.0 mm/5.0 mm，滴入具有温度梯度的二甲基硅油中(管口35 ℃，管底8 ℃)，滴距为8 cm，滴速为50滴/min，即得，滤纸吸干，置于容器中。平行制备3批滴丸，按照2020年版《中国药典》要求检测，测得平均溶散时限为(9.54±0.25)min，丸重差异为(3.89±0.17)%，直径为(3.91±0.06)mm，每粒丸重为(40.10±0.23)mg。

2.5 溶出度测定 取二氢杨梅素、磷脂复合物(以二氢杨梅素计，含量为40 mg)适量，加入3 mL蒸馏水，置于截留分子量8 000～10 000 Da的透析袋中。另取17粒滴丸(以二氢杨梅素计，含量约为40 mg),置于透析袋中，同法操作[13]，平行6份，在温度37 ℃、转速100 r/min、释放介质900 mL蒸馏水的条件下，于0、5、15、30、60、90、120、240、480 min各取样3 mL，并补加3 mL空白溶出介质，0.45 μm微孔滤膜过滤，测定溶出度，结果见图3。由此可知，二氢杨梅素240 min内累积溶出度为31.93%，制成磷脂复合物后提高至63.74%，再进一步制成滴丸后在30 min内基本溶出完毕，累积溶出度达95.43%。

图3 二氢杨梅素体外溶出曲线(n=6)Fig.3 In vitro dissolution curves for dihydromyricetin (n=6)

2.6 体内药动学研究

2.6.1 灌胃液制备 取二氢杨梅素、磷脂复合物、滴丸适量，0.5%CMC-Na溶液制成含二氢杨梅素15 mg/mL的混悬液，即得。

2.6.2 分组、给药及采血 18只大鼠随机分为3组，按100 mg/kg剂量分别灌胃给予“2.6.1”项下3种灌胃液，于0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10 h乙醚麻醉，眼眶采血各约0.3 mL，棉球止血，将血样置于离心管中(滴入2滴1%肝素)，摇匀，4 000 r/min离心2 min，取上层血浆，作好标记，冷冻保存。

2.6.3 内标溶液制备及血浆样品处理 参考文献[7]报道，精密称取芹菜素对照品10.0 mg，溶于50 mL乙腈中，再用乙腈稀释至400 ng/mL，即得。取血浆样品、内标溶液各100 μL，混匀后加入0.5 mL乙酸乙酯，涡旋5 min，8 000 r/min离心10 min，取上层有机溶剂，N2吹干得残渣，100 μL乙腈复溶，转移至带有内衬管的进样瓶中。

2.6.4 方法学考察 将对照品溶液稀释至4.0、2.0、1.0、0.5、0.1、0.05 μg/mL，进样针分别吸取100 μL，N2吹干得残渣，加入空白血浆、内标溶液各100 μL，按“2.6.3”项下方法操作，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以二氢杨梅素质量浓度为横坐标(X)，二氢杨梅素、芹菜素峰面积比值为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=0.031 8X-2.310 7(r=0.994 2)，在0.05～4.0 μg/mL范围内线性关系良好。

取0.05、1.0、4.0 μg/mL血浆对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下各进样测定6次，测得峰面积RSD分别为4.24%、3.69%、3.03%，表明仪器精密度良好。取磷脂复合物给药1 h后的血浆样品，室温下于0、4、8、12、18、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得二氢杨梅素、芹菜素峰面积比值RSD为7.11%，表明样品在24 h内稳定性良好。再取上述3个质量浓度的血浆对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得平均加样回收率分别为91.68%(RSD=3.06%)、87.07%(RSD=4.13%)、94.65%(RSD=2.74%)。

2.6.5 结果分析 图4、表2显示，与二氢杨梅素比较，磷脂复合物Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.05，P<0.01)，但tmax无明显变化(P>0.05)；与磷脂复合物比较，滴丸Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，tmax缩短(P<0.01)；磷脂复合物、滴丸分别将二氢杨梅素的口服吸收生物利用度提高至1.68、3.72倍。

表2 二氢杨梅素主要药动学参数Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for

图4 二氢杨梅素血药浓度-时间曲线(n=6)Fig.4 Plasma concentration-time curves for dihydromyricetin (n=6)

3 讨论

目前国内尚无官方提供二氢杨梅素对照品，故课题组采用定量核磁技术对原料药含量进行了标定[14]。磷脂复合物的制备一般要求在非质子溶剂中进行，赵薪苑等[4]采用质子溶剂(甲醇)也制备了二氢杨梅素磷脂复合物，但其复合率往往会受到影响[10]，而且也会影响磷脂复合物稳定性，不利于保存。

为了改善二氢杨梅素磷脂复合物的分散性，课题组进一步将其制成滴丸，发现其溶出速率及溶出度得到有效改善，tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞均有显著变化，生物利用度提高至3.72倍(磷脂复合物口服仅提高至1.68倍)。很多研究者采用固体脂质纳米粒、纳米结构脂质载体、脂质体等[15-16]技术来改善磷脂复合物溶出问题，但由于该制剂难免会接触水相，容易导致其发生解离[17]，故稳定性存在一定问题。本实验将二氢杨梅素磷脂复合物制成滴丸，避免了水相的使用，可使其溶出度及生物利用度大大提高，而且操作过程简单，适合国内中药公司实际生产水平，推广意义较大。