傅心雨，石玉华，郑梦洁，吕 倩，师福山

(浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058)

细胞焦亡(pyroptosis)是一种依赖Caspase(含半胱氨酸蛋白水解酶)的具有促炎性的程序性细胞死亡，其特征是细胞膜失去完整性并形成孔洞，导致细胞肿胀破裂，该过程在抵抗微生物感染中起到重要作用[1]。细胞焦亡的发生可分为经典途径和非经典途径，分别依赖Caspase-1和Caspase-4/5/11[2]。当细胞中的模式识别受体(PRR)接受病原刺激信号后，炎症小体组装并导致自身激活以及Caspase-1的活化，活化的Caspase-1一方面切割Pro-IL-1β产生成熟的IL-1β，另一方面切割GSDMD产生N端GSDMD(GSDMD-p30)并在细胞膜上形成孔洞，导致细胞肿胀破裂，为经典途径的细胞焦亡[3-5]。非经典途径为小鼠Caspase-11或人Caspase-4/5的前体直接识别并结合脂多糖(LPS)从而导致Caspase-4/5/11活化并直接切割GSDMD，导致细胞焦亡[6-7]。因此，细胞焦亡被认为是GSDMD介导的程序性细胞死亡，其中GSDMD属于Gasdermin家族，在哺乳动物中高度保守，并在不同组织和细胞中广泛表达[2,8]。其N端结构域与C端结构域形成自抑制结构，导致静息状态下的GSDMD没有活性，仅当活化的Caspase-1或Caspase-4/5/11作用于天冬氨酸切割位点时，GSDMD才能被切割并且在胞膜上打孔[9-10]。GSDMD也与诸多基因性疾病相关，但其激活机制尚不清楚，本研究旨在构建经典途径的细胞焦亡体外模型，为进一步研究激活机制建立稳定的模型。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株及细胞株真核表达质粒p3×FLAG-CMV-7.1、pCMV-N-MYC、pcDNA3.1-MYC-C及人胚肾细胞HEK293T细胞株均由本实验室保存；感受态细胞E.coli.DH5α购于北京全式金生物技术有限公司。

1.2 主要试剂RNA-Quick Purification Kit购于上海奕杉生物科技有限公司；PCR试剂盒、反转录试剂盒及DNA Marker购于南京诺唯赞(Vazyme)生物科技有限公司；……