毋传铿 河南省焦作市第三人民医院检验科 454500

结核性脑膜炎属于较严重的结核性疾病，是由于结核分枝杆菌感染脑部组织引起的非化脓性炎症。该细菌属于兼性细胞内致病菌，能够引起诸多无症状潜伏感染和进行性疾病[1]。在其感染类型中，结核性脑膜炎是常见的肺外结核感染类型之一，但儿童感染致死率较高[2]。结核性脑膜炎在初次感染1年内发病率最高，由于临床症状不典型，缺乏特异性的诊断指标，易被误诊为化脓性脑膜炎、病毒性脑炎及脑部肿瘤等。由于结核性脑膜炎病情发展迅速、早期不易明确诊断及预后不良等情况，亟需寻找快速准确的诊断方法。近年来，分子生物学在临床检验上得到了广泛应用，荧光定量PCR技术已经能够对各种病原学做出快速准确诊断[3]。本文中采用荧光定量PCR检测、抗酸染色涂片法及MTB培养法3种检测方法进行对比分析，探讨荧光定量PCR检测方法在结核性脑膜炎诊断中的意义。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年6月—2020年6月在我院就诊的具有脑膜刺激征患者104例，其中男50例，女54例，年龄26～55岁，平均年龄(39.4±16.6)岁。根据是否确诊对其进行分组，其中非结核性脑膜炎组32例(病毒性脑膜炎13例、化脓性脑膜炎12例、脑部肿瘤7例)，确诊结核性脑膜炎组48例，疑似结核性脑膜炎组24例。对三组患者进行腰椎穿刺术留取脑脊液5ml，及时送检。

1.2 纳入标准 确诊结核性脑膜炎标准：(1)经影像学检查，显示大脑外侧裂或基底池存在渗出物，脑回增强或脑积水；在脑膜炎病变基础上，在脑脊液中检测到结核分枝杆菌，或者在肺结核基础疾病上，同时脑脊液检测：蛋白定量升高，氯化物、葡萄糖水平降低；皮肤结核菌素试验显示阳性。(2)恶性肿瘤、寄生虫、细菌、真菌等细胞学检查，均为阴性。(3)抗结核治疗有效。疑似患者标准：发病时间>5d，神志改变，脑脊液检查：血浆葡萄糖与脑脊液比值>0.5，以淋巴细胞为主；颅脑CT或MRI检查异常，眼底检查异常，合并有其他部位的结核。满足以上4项为疑似患者。非结核性脑膜炎标准：脑膜炎类型已诊断明确，包括化脓性脑膜炎、病毒性脑膜炎、脑部肿瘤及脑外伤等。

1.3 方法

1.3.1 住院仪器与试剂：抗酸染色剂由北京世济合力生物科技有限公司生产，荧光定量PCR试剂由赛默飞世尔科技公司生产，仪器为ABI-PCR扩增仪。

1.3.2 抗酸染色涂片法：留取2ml脑脊液，离心机以12 000r/min速度离心，时间为15min，留取沉渣进行涂片，抗酸染色镜检，操作步骤遵照《结核病细菌学检验规程》。

1.3.3 结核分枝杆菌培养法：采用液体培养法，细菌与营养物质充分接触，利于结核分枝杆菌快速增长，以结核分枝杆菌培养阳性为标准。

1.3.4 荧光定量PCR检测 按照试剂盒操作流程处理脑脊液：留取脑脊液500μl、进行浓缩，取200μl浓缩液，震荡混合均匀，离心机以12 000r/min离心速度离心，时间为3min，去除上清液；加入生理盐水1ml，重悬沉淀，以12 000r/min离心速度再次离心，时间为3min，去除上清液，沉淀后备用。吸取50μl的核酸释放剂，充分混合均匀。放置3～5min备用，吸取36μl PCR反应液、内标液1μl、酶结合物2μl及制备好的样本液5μl。设置温度为94℃进行预变性5min；然后设置温度94℃持续15s，57℃持续30s，进行40个循环；结果判定标准：Ct值>39的样本，内标检测为阳性，结果判定为阴性；Ct值≤39，曲线为标准的S形，结果判定为阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0软件包进行数据分析。阳性率比较采用χ2检验，MTB DNA水平比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3种检验方法检测MTB阳性率比较 确诊结核性脑膜炎组的荧光定量PCR、抗酸染色涂片及MTB培养阳性率均高于疑似结核性脑膜炎组，差异具有统计学意义(P<0.05)，荧光定量PCR检测阳性率高于抗酸染色涂片及MTB培养，差异均具有统计学意义(P<0.05)；荧光定量PCR灵敏性为70.83%(34/48),特异性为70.83%(17/24)；抗酸染色涂片灵敏性为8.33%(4/48)，特异性为95.83%(23/24)；MTB培养灵敏性为16.67%(8/48)；特异性为87.50%(21/24)；荧光定量PCR与抗酸染色涂片法、结核分枝杆菌培养法比较，具有更高的灵敏性(P<0.05)。32例非结核性脑膜炎患者脑脊液不同检测方法检测均为阴性。见表1。

表1 3种检验方法检测MTB阳性率比较

2.2 结核分枝杆菌DNA检测 确诊结核性脑膜炎组患者MTB DNA对数值为4.627±0.816，疑似结核性脑膜炎组患者MTB DNA对数值为4.354±0.928，组间差异无统计学意义(P>0.05)

3 讨论

结核性脑膜炎是结核分枝杆菌感染引起的非化脓性炎症，可导致脑膜、脑实质及脑血管等组织损伤[4]。结核性脑膜炎是最为常见的肺外结核类型之一，约占1%。该疾病发病凶险，死亡率高达30%左右，尤其是儿童患者[5]。因此，早期诊断、早期干预是治疗的关键。结核性脑膜炎症状繁多，脑脊液实验室检查缺乏典型变化特征，病原学检测和生化检查敏感度和特异性低，在发病早期，影响疾病的诊断[6]。因此，寻找新的检测方法以提高检测的特异性和敏感性十分必要。

目前，细菌学检测仍是结核性脑膜炎的诊断标准，实验室检测主要包括抗酸染色涂片及MTB培养法。抗酸染色涂片的特点为快速、费用低廉、易操作，但是其特异性、敏感度均较低[1]。目前，MTB培养法为结核诊断的金标准，该检测方法特异性高，但是培养时间较长，需4～6周才能得到检测结果，并且仅有活菌才有可能培养成活，往往影响结核的早期诊断[7]。荧光定量PCR技术在临床上得到了广泛的应用，其敏感度、特异度均较高，对病原体的检测非常简便。高丽等[8]学者研究显示结核分枝杆菌T细胞斑点试验具有更高的敏感度和特异性，但是研究提到该技术要求较高，并且检测费用昂贵，尚处于推广阶段。结核分枝杆菌PCR在诊断方面的优势仍无法被取代。

本文中，确诊结核性脑膜炎组的荧光定量PCR、抗酸染色涂片及MTB培养阳性率高于疑似结核性脑膜炎组(P<0.05)，荧光定量PCR检测阳性率高于抗酸染色涂片及MTB培养阳性率，且具有更高的灵敏性(P<0.05)。32例非结核性脑膜炎患者脑脊液不同检测方法检测均为阴性。确诊结核性脑膜炎组与疑似结核性脑膜炎组在结核分枝杆菌DNA水平方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明荧光定量PCR对疑似和确诊结核性脑膜炎检测水平是一致的。本研究结果阳性率与刘喆等[9]学者报道的53%～82%相一致，远远高于抗酸染色涂片和结核分枝杆菌培养等传统方法。但是仍然存在29.17%的假阴性患者，分析原因，可能与以下因素相关：(1)部分结核性脑膜炎患者已经在他院经过抗结核治疗，入院后检测可能影响阳性检出率。(2)结核分枝杆菌DNA拷贝数偏低。在炎症早期，未达到检测试剂下限。结核分枝杆菌DNA拷贝量的检测下限为4.14×103，脑脊液MTB DNA拷贝数为低于检测下限，表明疾病处于早期阶段，或者由于血脑屏障的作用，影响荧光定量PCR的检测结果。因此，对于疑似结核性脑膜炎患者应及时复查MTB DNA，以明确诊断，提高结核分枝杆菌检测的阳性率[10]。

荧光定量PCR检测虽然不能替代传统检测方法，但是该检测技术较为成熟，已经在临床上广泛应用，且敏感性和特异性均较高。对于结核性脑膜炎的早期诊断，尤其是对一些传统检测方法及临床症状不典型的病例，其检测结果具有重要的参考价值。因此，对于存在有结核性脑膜炎临床症状的患者，应当早期连续进行荧光定量PCR检测。