赵芳芳 迟博 李大海 冯君桃

(广西医科大学第一附属医院妇产科，广西 南宁 530021)

宫腔粘连(Intrauterine adhesions，IUA)是由于子宫内膜损伤、纤维化，最终导致宫腔闭塞的妇科常见病，多因人工流产术、宫腔手术及感染引起，目前临床治疗主要以宫腔镜分离术、物理屏障放置、激素周期治疗及中药方剂治疗等方法为主[1]。桃红四物汤为中医调经名方，能有效改善妇科各类疾病。临床研究表明，桃红四物汤对宫腔粘连具有良好的疗效[2]，但其对IUA的作用机制尚未阐明。NF-κB/TGF-β1/Smad通路介导的子宫内膜纤维化是IUA重要的发病机制[3-4]。本研究拟选取IUA大鼠模型为研究对象，予以桃红四物汤高、中、低剂量进行治疗，基于NF-κB/TGF-β1/Smad通路探讨桃红四物汤治疗IUA的作用机制，旨在为IUA的防治提供新的思路和依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料 8～10周龄的雌性SD大鼠购于广西医科大学实验动物中心，SPF级，体质量250～280 g，共50只，生产许可证号：SCXK(桂)2014-0002。桃红四物汤(桃仁、当归、白芍各9 g，红花、川芎各6 g，熟地黄12 g)饮片由我院药剂科提供，参照文献[5-6]将饮片用75%乙醇提取浓缩至生药含量为2 g/mL提取液。本研究按照动物伦理要求，并经医院伦理委员会审核批准。

1.2 实验主要试剂及仪器 琼脂糖(Solarbio A8201-10g)、TRIzol Reagent(Invitrogen，15596026)、逆转录试剂盒(Takara，RR047a)、SYBR Green qPCRMix(Monad，MQ10301)、BCA蛋白定量试剂盒(Solarbio PC0020)、ECL化学发光底物(超敏)(Biosharp BL523A)、Anti-α-SMA一抗(abcam, ab32575)、Anti- Col Ⅰ一抗(abcam, ab34710)、Anti-FN一抗(abcam, ab34710)、Anti-NF-κB一抗(CST 8242)、Anti-p-NF-κB一抗(Santa Cruz sc-136548)、Anti- TGF-β1一抗(abcam, ab92486) 、Anti-p-Smad2一抗(abcam, ab53100)、Anti-Smad2一抗(abcam, ab33875)、Anti-p-Smad3一抗(abcam, ab52903) 、Anti-Smad3一抗(abcam, ab40854)、Anti-Smad7一抗(Santa Cruz sc-101152)、Anti-p-SMAD7一抗(Bioss antibodies, bs-20024R)、 Anti-β-actin一抗(abcam, ab8227)、山羊抗鼠二抗(Sigma A9309)、山羊抗兔二抗(Sigma A9169)、Rat TNF-α ELISA Kit(Elabscience E-EL-R2856c)、Rat IL-18 ELISA Kit(Elabscience E-EL-R0567c)、Rat IL-6 ELISA Kit(Elabscience E-EL-R0015c)、实时荧光定量PCR仪(Agilent Technologies，G8830-64001)、多功能酶标仪(美国MD FilterMax F3)、电泳转膜仪(Bio-Rad PowerPac Basic)、凝胶成像系统(上海天能Tanon 5200)、NanoReady超微量紫外可见分光光度计(杭州遂真生物FC-1100)。

1.3 IUA模型建立 为避免不同月经周期体内雌孕激素水平变化对检测结果的影响，常规阴道涂片进行观察，于大鼠动情期进行手术。参照文献[7]，大鼠经10%水合氯醛麻醉后，无菌环境下切开大鼠下腹部，暴露子宫，于宫颈上方约5 mm处作纵行切口，自制大鼠宫腔刮勺经切口对大鼠行刮宫术，待宫腔四壁出现粗糙感时停止刮宫。将浸泡于脂多糖溶液的棉线置入已行刮宫术的宫腔，在腹壁留一定长度棉线以便下一步取出棉线。生理盐水冲洗腹腔后缝合大鼠腹壁。24 h后取出脂多糖棉线。

1.4 分组及给药 行刮宫手术大鼠随机分为5组，分别为IUA模型组、桃红四物汤高、中和低剂量组，每组各10只；同时选取10只大鼠作为正常组，不进行任何处理。大鼠于刮宫术后第一天予以桃红四物汤提取液治疗。桃红四物汤高、中、低剂量组按18 g/kg、9 g/kg及4.5 g/kg给药量进行灌胃[8]。各组治疗时长为4个生理周期，共24 d。治疗完成后，收集各组大鼠子宫组织进行实验。

1.5 RT-qPCR检测各组子宫组织总RNA TRIzol法提取各组子宫组织总RNA。紫外分光光度计测定RNA的纯度及浓度后，采用逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA。设计并合成目的基因引物，见表1。引物由上海吉玛生物有限公司合成。加入SYBR green Ⅰ染料进行PCR扩增，扩增条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共45个循环。进行溶解曲线检测，按2-ΔΔCt进行数据分析。

表1 引物序列

1.6 Western blot检测子宫组织蛋白水平 取各组大鼠子宫组织冰浴裂解超声匀浆提取蛋白，采用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，按照15 μg上样量进行样品配平后，100℃金属浴10 min，使蛋白变性。将蛋白样品加入至SDS-PAGE凝胶中，进行电泳、转膜、5%脱脂牛奶室温封闭等操作。以适宜浓度加入目的蛋白一抗于4℃过夜孵育。TBST洗涤，加入HRP标记二抗室温孵育1 h，TBST洗净后采用ECL法显影，凝胶成像系统进行拍照。分析条带灰度值，计算目的蛋白与内参的比值。

1.7 ELISA检测TNF-α、IL-18、IL-6浓度 取各组样品及标准品，每孔100 μL，依据TNF-α、IL-18、IL-6 ELISA试剂盒使用说明书进行操作，在酶标仪450 nm波长处以阴性对照孔调零，检测各孔光密度值(OD)，根据标准品检测结果描绘标准曲线，计算各组TNF-α、IL-18、IL-6的浓度。

2 结果

2.1 桃红四物汤对IUA大鼠子宫组织纤维化标志物的影响 与对照组比较，IUA模型组大鼠子宫内膜组织中α-SMA、Col Ⅰ、FN mRNA及蛋白表达均显著升高(P<0.05)；与IUA模型组比较，桃红四物汤组可显著下调大鼠子宫组织中α-SMA、Col Ⅰ、FN mRNA及蛋白表达(P<0.05)，且中、高剂量组效果更显著(P<0.05)，见图1。

图1 各组α-SMA、Col Ⅰ、FN的表达水平(n=10)

2.2 桃红四物汤对IUA大鼠子宫组织炎症反应的影响 与对照组比较，IUA模型组大鼠子宫内膜组织中TNF-α、IL-18、IL-6 mRNA及蛋白表达均显著增加(P<0.05)；与IUA模型组比较，桃红四物汤组可显著下调大鼠子宫组织中TNF-α、IL-18、IL-6 mRNA及蛋白表达(P<0.05)，且中、高剂量组效果更显著(P<0.05)，见表2、图2。

表2 各组TNF-α、IL-18、IL-6的蛋白表达水平

图2 各组TNF-α、IL-18、IL-6 mRNA的表达(n=10)

2.3 桃红四物汤对NF-κB/TGF-β1/Smad信号通路的影响 采用Western blot检测各组大鼠子宫组织NF-κB/转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路相关蛋白的表达。结果表明，与对照组比较，IUA模型组大鼠子宫内膜组织中p-NF-κB、NF-κB、TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3的表达均显著升高，p-Smad7、Smad7表达显著降低(P<0.05)；与IUA模型组比较，桃红四物汤组可显著下调大鼠子宫组织中p-NF-κB、NF-κB、TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3的表达，上调p-Smad7、Smad7表达(P<0.05)，且中、高剂量组效果更显著(P<0.05)，见图3。

图3 各组NF-κB/TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白的Western blot检测结果(n=10)

3 讨论

IUA形成主要因刮宫等宫腔机械操作损伤及宫腔炎症感染所致，由此造成过度炎症反应，子宫内膜受损，细胞外基质(ECM)蛋白和细胞因子分泌异常，胶原蛋白沉积在内膜而致其纤维化，最终导致粘连发生[9]。α-SMA、Col Ⅰ、FN是ECM的重要组成部分，可用于判断纤维化疾病的发生、发展[10-12]，并在IUA患者粘连组织中高度表达[13]。纤维化进展又受炎症反应的调节，TNF-α、IL-18及IL-6是机体主要的促炎因子，可抑制ECM的降解，促进子宫内膜纤维化。研究指出，TNF-α、IL-18及IL-6在IUA患者子宫内膜组织中表达上调，且与IUA程度成正相关[14]，表明α-SMA、Col Ⅰ、FN、TNF-α、IL-18及IL-6水平均可作为IUA子宫纤维化及炎症反应的判断指标。本研究通过刮宫及感染双重损伤建立IUA大鼠模型，结果发现，IUA大鼠子宫组织中α-SMA、Col Ⅰ、FN、TNF-α、IL-18及IL-6的表达明显高于正常大鼠，与IUA发生发展机制一致，证实IUA模型造模成功，表明抗纤维化及抗炎是阻断IUA进展的关键策略。

中医学认为，IUA属“闭经”“月经过少”“通经”的范畴；病因病机为先天禀赋不足，受器械伤，使肾气损伤，外邪入里而湿热下注，淤血停滞，治疗当以温肾阳，祛湿热补气血为主[15]。桃红四物汤为四物汤改良方，有补血养血，活血化瘀之效，是治疗妇人气(血)虚瘀血内阻之证，祛瘀生新的代表方[16]。临床研究表明，桃红四物汤在治疗轻中度IUA患者方面有效率达91%以上[17]。中医“湿热瘀结证”与现代医学“炎症”及“纤维化”理论相关联。临床研究发现桃红四物汤方对肝纤维化也具有良好的治疗效果[18]。本研究发现，桃红四物汤可显著降低IUA大鼠子宫组织中α-SMA、Col Ⅰ、FN、TNF-α、IL-18及IL-6的表达，表明桃红四物汤可通过发挥抗纤维化和抗炎效应进而抑制IUA进展。

NF-κB是一种转录因子，可介导炎症反应、细胞分化、氧化应激等生物过程[19]。当细胞受到刺激时，NF-κB磷酸化激活，入核启动下游如TNF-α、IL-18、IL-6等炎症因子合成，促进炎症反应[20-21]，并且NF-κB还可通过与TGF-β1启动子位点结合，促进TGF-β1表达[22]。TGF-β1又可与细胞膜特异性受体结合，诱导Smad2和Smad3磷酸化，再与Smad4结合构成复合物进入胞核，调控ECM蛋白的基因转录，促进纤维化[23]；而Smad7作为TGF-β1/Smad信号通路的抑制调节因子被下调，从而减少其与TGF-β1受体的结合，降低对Smad2和Smad3磷酸化的抑制作用，进一步促进IUA形成[24]。既往研究已证实IUA患者粘连组织中NF-κB、TGF-β1和Smad3上调，而Smad7下调[25]，提示NF-κB/TGF-β1/Smad通路激活可能促进了IUA纤维化。本研究基于NF-κB/TGF-β1/Smad通路，进一步研究桃红四物汤治疗IUA的分子机制，发现IUA大鼠模型中NF-κB/TGF-β1/Smad通路被激活，与IUA子宫内膜纤维化机制一致，而桃红四物汤可显著降低TGF-β1和NF-κB、Smad2、Smad3表达及活化，促进Smad7活化，表明桃红四物汤治疗IUA的机制可能是通过抑制NF-κB/TGF-β1通路的激活进而发挥抗纤维化和抗炎效应。

4 结论

桃红四物汤可明显抑制NF-κB/TGF-β1/Smad信号通路的激活，降低IUA大鼠子宫组织中α-SMA、Col Ⅰ、FN、TNF-α、IL-18及IL-6的表达，发挥抗纤维化及抗炎效应，表明抑制NF-κB/TGF-β1/Smad通路活化是桃红四物汤治疗IUA的重要机制，为桃红四物汤的机制研究奠定了基础。