贺 英，霍治军，艾海舰，王 梅，霍彦波，王倩茹

（1.榆林学院生命科学学院，陕西 榆林 719000；2.榆林市现代农业培训中心，陕西 榆林 719000）

马铃薯早疫病俗称夏疫病、轮纹病或干斑病，是一种气传的多循环单年流行病害，主要危害植株叶片，也会感染茎秆和块茎[1]。马铃薯早疫病于1892年在美国的佛蒙特州首次发现，目前世界各地均有分布[2]。榆林市为中国马铃薯四大产区之一，2020年马铃薯种植面积全市可达16.92万hm2[3]。由于氮肥施用量增加和种苗材料品质弱等的影响，榆林市早疫病的发生越来越普遍与严重，逐渐成为马铃薯产量的限制因素，是仅次于晚疫病的第二大真菌病害。目前化学防治仍是生产上控制马铃薯早疫病的重要手段，也是确保马铃薯高产、稳产的重要措施[4-7]。但是，生产中长期大量使用固定几种农药，使得病原产生抗药性，防治效果变差，同时过度使用农药，引起生态环境安全问题也亟需解决[8]。植物病原菌的分离与鉴定是病害生物学、流行病学研究以及病害有效防控的基础[9]。然而，目前尚无文献报道引起榆林市马铃薯早疫病的链格孢菌的具体种类。因此，明确榆林市马铃薯早疫病病原，筛选高效低毒防治药剂，是马铃薯生产和保护环境的迫切需求。鉴于此，本研究鉴定榆林市马铃薯早疫病病原菌，并通过室内毒力试验，初步确定病原菌株敏感药剂，为马铃薯早疫病田间防治筛选低毒高效药剂奠定基础。研究结果可为榆林市马铃薯早疫病的科学防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料和药剂

1.1.1 供试材料

对榆林市马铃薯种植主产区进行早疫病的病叶采集，大田采集后置于冰盒密封标记，4℃保存备用。

1.1.2 供试药剂

供试药剂名称、剂型、生产厂家及稀释倍数见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌种类的鉴定

采用常规组织培养法分离病原菌株，培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato dextrose agar，PDA），28℃培养7 d。将分离纯化所得不同真菌进行柯赫氏法则验证，得到马铃薯早疫病病原菌。在光学显微镜下对马铃薯早疫病病原菌进行形态观察鉴定。4℃保存菌种备用，将保存的菌种送至奥维森测序公司进行分子鉴定。

1.2.2 含药培养基的制备

应用含毒介质法配置PDA 培养基。无菌条件下，用无菌水将各供试药剂按表1 中的稀释倍数进行稀释，并且各取6 mL 加入60 mL 的培养基中摇匀后进行高压灭菌，无菌操作台上将各含药培养基分装入灭菌后的培养皿中，每个供试药剂有5 个不同稀释处理，以无菌水作对照，每个处理重复3 次。

表1 供试药剂Table 1 Fungicides used in experiment

1.2.3 抑菌活性的测定

采用生长速率法，在无菌条件下，用打孔器在纯化的平板菌种菌落边缘处打直径为0.8 cm 的菌饼，移至含药培养基中，放入25℃培养箱中培养8 d，5 d 后使用游标卡尺十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。抑菌率（%）=（对照组菌落直径-试验组菌落直径）/对照组菌落直径×100。

1.3 数据处理

用MEGA 7 软件进行序列分析，邻接法（Neighbor-joining， NJ）构 建 系 统 发 育 树 ，Bootstrap 设置为1 000；试验数据用Excel 2019 进行整理分析，用IBM SPSS Statistic 23.0 进行单因素方差分析并计算EC50和EC95的值。

2 结果与分析

2.1 马铃薯早疫病病原菌分离鉴定结果

2.1.1 马铃薯早疫病病原菌形态学鉴定

马铃薯早疫病叶片病斑为褐色圆形斑点，逐渐扩大至近圆形，褐色至暗褐色，病斑边缘明显，有清晰的同心轮纹，病斑上可产生少许黑色霉状物（图1a、图1b）。采用组织分离法分离马铃薯早疫病病原菌，将分离纯化所得不同真菌进行柯赫氏法则验证，得到马铃薯早疫病病原菌，记作真菌-1，PDA 培养病原菌真菌-1 菌落呈暗黑色（图1c、图1d）。显微观察，成熟菌丝呈暗褐色，菌丝有隔膜和分枝（图1e）。分生孢子自分生孢子梗顶端产生，通常为单生，很少有两个成串，倒棍棒形，黄褐色，2～8 个横隔膜，0～4 个纵隔膜，隔膜处有缢缩，大小43～90 μm × 10～15 μm。喙细长，与孢体等长或略短，淡色，有2～7 个横隔膜，孢身至喙逐渐变细（图1e、图1f）。根据中国真菌志及其相关文献查询，结合形态学特征，鉴定榆林市马铃薯早疫病病原菌属链格孢属（Alternaria）。

图1 马铃薯早疫病症状及病原菌落、分生孢子Figure 1 Symptoms, colonies and conidial morphology of potato early blight

2.1.2 马铃薯早疫病病原菌分子鉴定及系统发育树

以分离纯化的马铃薯早疫病病原菌样本（真菌-1）的基因组DNA 为模板，选择真菌通用引物ITS1/ITS4 进行PCR 扩增，产物经测序后得到该病原菌株的rDNA-ITS 序列，经NCBI 数据库比对（BLAST）分析发现，真菌-1 的 rDNA-ITS 序列与NCBI 库中的多种链格孢属（Alternaria）真菌高度同源。基于比对结果，选择相似种真菌的rDNA-ITS序列进行系统发育树构建（图2），结果表明，供试菌株真菌-1 在系统发育树中与A.alternata（登录号：KX987252.1）聚为一枝，结合病原菌菌丝、分生孢子梗及分生孢子形态（图1），因此推测真菌-1 为 A.alternata。

图2 真菌-1 与相似种的ITS 序列的系统发育树（Phytophthora infestans 为外群）Figure 2 Phylogenetic tree of fungi-1 rDNA-ITS compared to similar species (Phytophthora infestans as outgroup)

2.2 9 种杀菌剂对A. alternata 的室内毒力测定

通过菌丝生长速率法测定9 种杀菌剂对A.alternata 的室内毒力，测定结果见表2。

由表2 中可知，供试杀菌剂对该病原的抑菌活性按照毒力由大到小的顺序依次为：噁酮·氟噻唑（SC）＞异菌·氟啶胺（SC）＞苯甲·百菌清（SC）＞烯酰·吡唑酯（WG）＞氟菌·霜霉威（SC）＞72%霜脲·锰锌（WP）＞69%烯酰·锰锌（WP）＞75%代森锰锌（WG）＞70%丙森锌（WP）；噁酮·氟噻唑（SC）、异菌·氟啶胺（SC）、苯甲·百菌清（SC）、烯酰·吡唑酯（WG）和氟菌·霜霉威（SC）的EC50值 分 别 为 3.601， 7.493， 21.113， 27.555 和51.874 μg/mL，EC50值在 3～52 μg/mL，EC95值分别为 124.987，489.168，1 338.277，3 011.257 和2 325.134 μg/mL，这表明以上5 种药剂抑菌效果较好，可供进一步田间试验使用，其中噁酮·氟噻唑、异菌·氟啶胺、烯酰·吡唑酯和氟菌·霜霉威随着有效成分浓度的增加，各药剂浓度的抑制作用显著增加，可见在生产中可提高这些药剂浓度以取得较好的防治效果，苯甲·百菌清随着有效成分浓度的增加，药剂浓度对抑菌率影响不显著，可见在生产中提高药剂浓度不能大幅度提升防治效果；75%代森锰锌和70%丙森锌的EC50值分别为 1 525.580 和 3 969.600 μg/mL，EC50值在1 500～ 4 000 μg/mL，可见 A. alternata 已对这 2种杀菌剂产生抗药性，在田间不可单独使用。

表2 9 种化学试剂对马铃薯早疫病病原菌的室内毒力Table 2 Toxicity measurement of different concentrations of fungicides to A. alternata

3 讨 论

国际上已报道的能引起马铃薯早疫病的链格孢菌有8 种，中国已报道的病原菌只有茄链格孢（A. solani）和链格孢（A. alternata）两种[2]，本研究通过形态学和分子生物学方法鉴定分离所得菌种，首次明确榆林市马铃薯早疫病病原菌为链格孢（A.alternata）。

本试验通过室内药敏试验筛选了5 种效果较好的药剂，分别是噁酮·氟噻唑（SC）、异菌·氟啶胺（SC）、苯甲·百菌清（SC）、烯酰·吡唑酯（WG）和氟菌·霜霉威（SC），可供进一步田间试验使用。在当地马铃薯早疫病防治上并未见使用噁酮·氟噻唑（SC）和异菌·氟啶胺（SC）。噁酮·氟噻唑（SC）通过对氧化固醇结合蛋白（OSBP）抑制达到抑菌效果，对卵菌纲病原菌具有独特的作用位点，具有内吸向顶传导、保护新生组织的特点，同时可以快速被蜡质层吸收，具有优秀的耐雨水冲刷作用，对病原菌具有预防、治疗和抑制产孢作用，其具有治疗高效、速效、持效、用量低、药效稳定的特点[10]。本试验中，噁酮·氟噻唑（SC）的EC50值为3.601 μg/mL，EC95值为124.987 μg/mL，对A. alternata 室内毒力测定在9 种药剂中效果较好，建议在生产中推广使用。氟啶胺是目前唯一的线粒体氧化磷酸化解偶联剂，在ATP 合成酶上有多个作用位点，由多基因控制，抗性风险极低，全球至今无抗性报道，杀菌速度与活性领先于同类化合物[11]。本试验中，测定异菌·氟啶胺（SC）对A. alternata 的毒力效果，EC50值为7.493 μg/mL，EC95值为 489.168 μg/mL，是毒力仅此于噁酮·氟噻唑（SC）的药剂。

本试验测定得出75%代森锰锌（WG）和70%丙森锌（WP）对马铃薯早疫病病原菌的毒力较差。这可能是近几年来，榆林市普遍使用75%代森锰锌（WG）和70%丙森锌（WP）两种试剂对马铃薯早疫病进行化学防治，使马铃薯早疫病对75%代森锰锌（WG）和70%丙森锌（WP）产生了抗性，因此不建议在田间单独使用这两种农药。

室内毒力测定是田间防效试验的基础，各药剂的真实防效需在本试验的基础上进一步进行田间防效试验，在田间防治使用时，建议结合马铃薯早疫病病原菌流行的关键时期设置多次喷药，发病中心重点施药等方法，以便取得最好的防治效果；田间防治亦可混合其他药剂使用，克服和延缓早疫病对农药的抗药性，从而保证防治效果。