杜 浩 ,李宗锴 ,只佳增,周劲松,张建春,陈伟强， 岳建伟 *

1云南省红河热带农业科学研究所，云南 河口 661300； 2开远市国家现代农业产业园管理委员会，云南 开远 661600

香蕉枯萎病，又称香蕉巴拿马病，是香蕉毁灭性、系统性维管束病害。病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)，按寄主类型共分为4个生理小种，其中，4号生理小种(Foc TR4)在我国南方香蕉主产区为害最重(李朝生等，2012)。目前，香蕉枯萎病还没有一种可完全根治的方法，选育抗(耐)枯萎病品种被认为是最有效的途径之一。对香蕉种质的抗枯萎病评价已有很多研究，但各种评价方法不统一，评价标准也不一致。如:陈厚彬等(2006)在4号生理小种枯萎病发生严重的田间测试了15份香蕉种质的抗性，结果表明,6份为抗,5份中抗,4份感病，未发现有高抗种质；刘以道等(2008)采用苗期盆栽伤根灌菌液的方法测定了36份香蕉种质对枯萎病4号生理小种的抗性，结果表明，13份为中抗,22份为感病,1份为高感，未发现有高抗种质；谢子四等(2009)通过苗期与田间相结合的评价方法，测定了10份香蕉种质对枯萎病4号生理小种的抗性，结果显示,3份为高抗,4份抗,3份中抗，未发现感病种质。

云南省红河热带农业科学研究所香蕉研究团队先后选育了“红研1号”“红研2号”“红研3号”“红研5号”“滇蕉1号”等品质优、特异性强的新品种，其中一些品种在推广种植中表现出较好的枯萎病抗性能力，但还未经过抗性评价试验明确其抗性水平。本研究立足于云南省红河热带农业科学研究所目前已获得授权的自主品种，利用PDB培养基孢子悬浮液灌注法、PDB培养基孢子悬浮液浸根法、无菌水孢子悬浮液灌注法3种接种方法，在3个孢子浓度下，进行香蕉枯萎病抗性评价方法的筛选，并评价7个香蕉品种的抗性水平，以期为自主香蕉品种的应用推广提供试验数据支持，同时为香蕉枯萎病的抗性评估研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试香蕉品种 生长一致的7个品种(巴西蕉、南天黄、红研1号、红研2号、红研3号、红研5号、滇蕉1号)香蕉组培苗。其中，“南天黄”为市场购买，其他品种为云南省红河热带农业科学研究所组培中心提供。用营养袋装入约0.8 kg的无菌土，移栽组培苗，正常水肥管理，待香蕉苗长至5～6片叶时，选取长势良好、大小一致的无病苗用于试验，并分别在各幼苗的营养袋上喷涂油漆以标记品种。

1.1.2 病原菌的鉴定与保藏 尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Foc TR4)病原菌，由云南省红河热带农业科学研究所香蕉团队在云南省河口瑶族自治县香蕉枯萎病发病植株上采集并分离，病原菌的鉴定工作由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所黄贵修研究员、杨洋博士协助完成。

1.2 试验方法

1.2.1 接种方法和接种浓度的筛选 选取已开展过相关抗性评价的高感品种巴西蕉(黄素梅等，2019)、中抗品种红研2号(杨智梅等，2019)、高抗品种南天黄(许林兵等，2017)为材料，研究苗期抗性评价方法。

PDB培养基孢子悬浮液灌注法：将Foc TR4菌株接种在PDA平板培养基上培养7 d后，取直径0.6 cm的菌饼接种于PDB培养基中，27 ℃、摇床暗培养6～7 d后，用4层纱布过滤掉菌丝，使用血球计数板计算出病菌孢子浓度，然后加无菌PDB培养基配制成2×104、2×105、2×106个·mL-13个浓度的病菌孢子悬浮液备用。接种时用小刀割伤香蕉少量根系，并接种相应浓度病原菌5 mL，每个品种香蕉接种15株，重复4次。

无菌水孢子悬浮液灌注法(左存武等，2010)：将Foc TR4菌株接种在PDA平板培养基上大量培养，28 ℃、暗培养10 d至长满整个培养皿，用无菌水将孢子冲洗下来，并用4层纱布过滤掉菌丝，用血球计数法计算孢子浓度，加无菌水配制成2×104、2×105、2×106个·mL-13个浓度的的病菌孢子悬浮液备用。接种时用小刀割伤香蕉少量根系，并接种相应浓度病原菌5 mL，每个品种香蕉接种15株，重复4次。

PDB培养基孢子悬浮液浸根法：取香蕉袋装苗，去除营养袋，轻轻剥除根际土壤，剪断少量根系，然后浸入孢子浓度为2×104、2×105、2×106个·mL-1的PDB培养基孢子悬浮液中，60 min后取出，重新移栽到营养袋中。

1.2.2 7个香蕉品种的苗期抗性评价 根据1.2.1结果，筛选最佳接种方法和接种浓度用于7个香蕉品种的苗期抗性评价试验。按筛选的最佳接种方法接种40 d后，调查香蕉苗发病情况，并分别根据表1、2进行苗期病害分级和抗性评价(李朝生等,2012； 谢子四等，2009)。抗性评价时，根据叶片症状和球茎症状得到的抗性级别不一致时，以“大”等级(抗性差者)作为该品种的抗性级别。

根据调查数据，计算发病率及病情指数(严重度)。发病率/%=发病株数/调查总株数×100；严重度=∑(各级级别数×该级别株数)/调查总株数。

表2 香蕉苗期抗性评价标准

1.3 田间抗性评价

1.3.1 试验地选取与试验方法 试验地位于云南省河口县南溪农场马肚白队(103.544° E，22.384° N，海拔290 m)，前作香蕉枯萎病发病率约60%。选取南天黄、红研1号、红研2号、红研3号、红研5号、滇蕉1号共6个品种，每个品种80株，标记后随机混合并种植在试验地中。香蕉定植后每4个月调查一次，分别记录发病率和死亡率，香蕉死亡或发病不进行补苗(避免补苗对后期调查工作造成干扰)，持续调查2代蕉。

1.3.2 田间抗性评价标准 枯萎病的田间诊断标准为：植株下部叶片黄化2片以上或假茎基部有2块以上叶鞘开裂且裂缝长度大于10 cm记为病株。根据收蕉前最后一次调查的香蕉死亡率作为田间抗性评价依据(黄素梅等，2014)，抗性评价标准参考黄秉智等(2005)分为高抗HR(死亡率<10%)、抗病R(10%≤死亡率<20%)、中抗MR(20%≤死亡率<40%)、感病S(40%≤死亡率<60%)、高感HS(死亡率≥60%)5个等级。

1.4 数据统计

使用Excel 2003和SPSS 22.0进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 接种方法和接种浓度的筛选

以球茎症状严重度作为发病严重度的标准，测定了3种接种方法在3个接种浓度下的抗性评价结果。结果表明(表3)：随Foc TR4孢子浓度的升高,各品种香蕉病害严重度均增加；3种接种方法中，以无菌水孢子悬浮液灌注法病害严重度最低，PDB培养基孢子悬浮液浸根法病害严重度最高，PDB培养基孢子悬浮液灌注法结果居中。在香蕉品种的抗性评价工作中，考虑到无菌水孢子悬浮液灌注法发病严重度较低，PDB培养基孢子悬浮液浸根法病害严重度最高，但接种时，需要将香蕉根系全部拔出，在PDB培养基孢子悬浮液中浸泡后再移栽，程序相对繁琐，所以在接种方法上，建议选择发病严重度居中的PDB培养基孢子悬浮液灌注法；而对于接种浓度的选择，在本研究中，使用2×105个·mL-1的PDB培养基孢子悬浮液灌注法，2个对照品种的抗性评价结果与已报道的南天黄为高抗(许林兵等，2017)、巴西蕉为高感(黄素梅等，2019)基本一致，建议选用接种浓度为2×105个·mL-1。

表3 接种方法和接种浓度对苗期抗性评价的影响

2.2 7个香蕉品种的苗期抗性评价

采用浓度2×105个·mL-1的PDB培养基孢子悬浮液灌注法对7个香蕉品种进行苗期抗性评价，结果表明：南天黄、红研3号为高抗，红研2号、红研5号、滇蕉1号为中抗，巴西蕉、红研1号为高感，其中，红研2号和红研5号球茎与叶片症状确定的抗性级别不一致，选用抗性级别较“大”者(抗性较差者)作为最终评价结果(表4)。

表4 7个香蕉品种苗期抗性评价

2.3 6个香蕉品种田间抗性评价

测定6个香蕉品种的田间抗性(表5)，结果表明：第1造蕉，发病率从高到低依次为巴西蕉(65.0%)>滇蕉1号(61.1%)>红研2号(32.5%)>红研5号(22.5%)>红研3号(12.5%)>南天黄(5.8%)；死亡率从高到低依次为巴西蕉(58.3%)>滇蕉1号(37.8%)>红研2号(25.0%)>红研5号(18.3%)>红研3号(12.5%)>南天黄(4.2%)。根据死亡率得到抗性水平为：南天黄为高抗，红研3号、红研5号为抗病，红研2号、滇蕉1号为中抗，巴西蕉为感病。

表5 6个香蕉品种的田间抗性评价

第2造蕉相比第1造蕉，所有香蕉品种的发病率和死亡率均升高；发病率从高到低依次为巴西蕉(91.7%)>滇蕉1号(87.5%)>红研2号(46.4%)>红研5号(32.5%)>红研3号(20.0%)>南天黄(11.7%)；死亡率从高到低依次为巴西蕉(85.0%)>滇蕉1号(51.3%)>红研2号(37.3%)>红研5号(29.2%)>红研3号(16.7%)>南天黄(9.2%)；根据死亡率得到抗性水平为：南天黄为高抗，红研3号为抗病品种，红研2号和红研5号为中抗，滇蕉1号为感病，巴西蕉为高感。

3 讨论

本研究通过PDB培养基孢子悬浮液灌注法、PDB培养基孢子悬浮液浸根法、无菌水孢子悬浮液灌注法3种接种方法，在2×104、2×105、2×106个·mL-13个浓度下，筛选香蕉种质苗期抗性评价最简便可行的方案。通过比较接种后的病害严重度发现，随接种孢子浓度的升高香蕉病害严重度增加，3种接种方法中，建议选择2×105个·mL-1的PDB培养基孢子悬浮液灌注法更为高效可行。

苗期抗性评价试验结果显示，南天黄、红研3号为高抗，红研2号、红研5号、滇蕉1号为中抗，巴西蕉、红研1号为高感。而田间抗性评价结果表明：第1造蕉，南天黄为高抗，红研3号、红研5号为抗病，红研2号、滇蕉1号为中抗，巴西蕉为感病；第2造蕉，南天黄为高抗，红研3号为抗病，红研2号和红研5号为中抗，滇蕉1号为感病，巴西蕉为高感。苗期与田间抗性评价结果不尽一致，苗期抗性评价结果受到蕉苗大小、接种方法、接种浓度等因素的影响；而在田间抗性评价中，随着种植年限的增加，本研究中第2造蕉抗性评价结果明显低于第1造蕉，且田间抗性评价结果受土壤Foc TR4孢子浓度、田间水肥管理措施、当地气候条件等多种因素的影响。所以香蕉种质的抗性评价应对各种因素作综合考量,以确定抗性标准。

在本研究中，综合苗期和田间抗性评价结果，7个香蕉品种的抗性由高到低为：南天黄>红研3号>红研5号>红研2号>滇蕉1号>巴西蕉>红研1号(红研1号未开展田间抗性评估，仅以苗期抗性评价为依据)，具体抗性评价为南天黄为高抗，红研3号和红研5号为中等抗性偏强，红研2号达到中抗水准，巴西蕉和红研1号为高度感病。需要加以说明的是,在苗期抗性评价中，根据球茎和叶片症状严重度,滇蕉1号均被评价为中抗水平，但球茎症状严重度(2.95)和叶片症状严重度(1.87)分别接近于中抗和感病的抗性评价临界值(3.0和2.0)；同时在田间抗性评价中，根据死亡率得到的抗性水平滇蕉1号第1造蕉为中抗，第2造蕉为感病，但相对于本研究中的其他品种，滇蕉1号表现出发病率远高于死亡率，所以仅以死亡率作为田间抗性评价的依据是不够全面准确的，考虑以上因素，本研究中滇蕉1号抗性评价为感病。