李雪莲， 吕 燕 ， 刘 芳， 张慧丽， 段维军*

1宁波检验检疫科学技术研究院，浙江 宁波 315012； 2宁波海关，浙江 宁波 315012；3中国科学院微生物研究所，北京 100101

近年来，国内木制品加工产业迅猛发展，我国木材及木制品需求量不断增加，国内本土木材已经满足不了市场的需求，不得不依靠进口来弥补国内缺口，我国已成为世界上第二大木材消耗国和第一大木材进口国。我国原木进口具有数量大、来源多、材种多等特点。据统计，我国原木进口量从1997年的447.1万m3增长到2018年的5975万m3(张嘉然等，2019)。原木来源涉及全球六大洲近百个国家和地区，包括400余种木材。原木进境口岸122个，陆路和海港口岸均有进口。由于进境原木为粗加工植物产品，携带疫情十分复杂，其中检疫性有害生物占总截获次数的比例高达25.41%(李瑞法等，2015)，口岸原木检疫工作面临严峻考验。尽管截获检疫性有害生物种类众多，但以往由进境原木中截获的疫情主要集中在昆虫和杂草类，植物病原菌物截获种类较少，仅有从比利时和荷兰进境的水曲柳FraxinusmandshuricaRupr.原木中截获苹果壳色单隔孢溃疡病菌BotryosphaeriastevensiiShoemaker(张露茜等，2015)的报道，亟需引起高度重视。

栎树猝死病由多枝疫霉PhytophthoraramorumWerres，De Cock & Man in′t Veld (Rizzoetal.，2002； Werresetal.，2001)引起，是一种未知起源、毁灭性的林木和观赏植物卵菌病害，一旦入侵立足后几乎无法根除(Brasieretal.，2004; Brasier & Webber，2010)。多枝疫霉隶属于假菌界Chromista卵菌门Oomycota霜霉目Peronosporales霜霉科Peronosporaceae疫霉属Phytophthora。该病菌于1993年在德国和荷兰有枯萎症状的杜鹃花RhododendronsimsiiPlanch.和荚蒾ViburnumdilatatumThunb.上分离获得，1995年美国加利福尼亚中北部沿海地区的密花石栎Lithocarpusdensiflorus和栎属Quercusspp.植物也有发现，给当地经济和森林生态系统造成了巨大损失。由其引起的病害危害严重，扩散迅速，寄主众多，且难以控制，短短几年间在北美、欧洲大面积扩散，引起世界各国科学家的重视和关注(Gossetal.，2011； Grünwaldetal.，2008； Ioosetal.，2006； Prosperoetal.，2007； Werres & Kaminski，2005； Werres & Zielke，2003)。目前，该病菌已被古巴、韩国、荷兰、加拿大、智利等多个国家列为检疫性有害生物。鉴于其严重危害性，我国已将栎树猝死病菌列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》(中华人民共和国农业农村部，2007)。

栎树猝死病菌能产生多种类型的孢子，在被侵染植物材料和土壤中越冬，近距离传播主要通过雨水滴溅、风和灌溉传播到植物组织上，远距离传播主要通过感病苗木等来自疫区的货物进行传播(李百胜等，2005； 王颖等，2002； Parke & Peterson，2019)。栎树猝死病菌可随植物产品贸易进行传播，必须密切防范该检疫性病菌的传入。2020年11月，宁波口岸从德国进境的云杉PiceaasperataMast.原木中发现夹带有疑似水青冈FaguslongipetiolataSeem.枝条，怀疑其可能携带栎树猝死病菌，对该枝条进行常规分离培养，并提取该枝条的DNA进行巢式PCR检测和DNA序列测定分析研究，检测是否携带有栎树猝死病菌，以期为口岸检疫、疫情防控及后续相关研究工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试样品 供试样品为自德国进境云杉原木中夹带的水青冈枝条，阳性对照为栎树猝死病菌质粒DNA，阴性对照为不携带栎树猝死病菌的杜鹃叶片DNA，空白对照为无菌水。

1.1.2 试剂材料 马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar， PDA)(杭州微生物试剂有限公司)含有氯霉素100 μg·mL-1，用于病菌分离、纯化和保存。核酸提取试剂盒为TANBead®Plant DNA Auto Kit(台湾奈米技术开发有限公司)，2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)，100 bp Marker[宝生物工程(大连)有限公司]，其他试剂均为分析纯。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 样品分离 从来自德国的进境云杉夹带的植物枝条及叶片中挑取有疑似症状的植物茎秆或叶片，采用常规分离方法进行分离。用1%次氯酸钠表面消毒3 min后，取出于无菌水中漂洗3次，无菌滤纸上吸干水分后，置于PDA培养基上，于25 ℃黑暗培养。待长出菌落后，纯化并观察。

1.2.2 基因组DNA提取 从供试样品中取有疑似症状的植物叶片，置于-80 ℃超低温冰箱冷冻，加液氮研磨，根据Kingfisher mL和TANBead®Plant DNA Auto Kit使用说明，提取3份样品DNA(编号：13271-1、13271-2、13271-3)。提取的DNA经分光光度计检测浓度后，冻存于-20 ℃冰箱备用。为鉴定寄主植物种类，挑取干净植物茎秆，剥去外皮，将植物茎秆切小段后，采用上述方法提取植物DNA。

1.2.3 寄主植物ITS序列扩增和测序 采用引物ITS5a/ITS4进行ITS片段扩增，ITS5a:5′ -CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3′(Stanfordetal.，2000)；ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(Whiteetal.，1990)。反应条件：94 ℃ 4 min；94 °C 45 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环，最后72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，有明显的特异性条带，确认扩增成功后，产物送上海华大基因科技有限公司进行双向测序。

1.2.4 栎树猝死病菌特异性引物PCR扩增和测序 参照SN/T 2080—2008《栎树猝死病菌检疫鉴定方法》(国家认证认可监督管理委员会，2008)中的PCR方法，采用特异性引物对所提取样品基因组DNA(编号：13271-1、13271-2、13271-3)进行巢式PCR，首轮PCR引物对为Phyto1(5′-CATGGCGAGCGCTTGA-3′)和Phyto4(5′-GAAGCCGCCAACACAAG-3′)；第2轮引物对为Phyto2(5′-AAAGCCAAGCCCTGCAC-3′)和Phyto3(5′-GGTGGATGGGGACGTG-3′)。其中，第2轮DNA样品为稀释100倍的首轮PCR产物。

用实验室制备的栎树猝死病菌质粒DNA作为阳性对照，无菌水作为空白对照，用不携带栎树猝死病菌的杜鹃叶片DNA作为阴性对照。两轮PCR反应体系和反应条件均相同，50 μL反应体系：25 μL 2×Taq Master Mix，3 μL正向引物(10 μmol·L-1)，3 μL反向引物(10 μmol·L-1)，10 μL 模板DNA，加ddH2O至50 μL；反应条件： 94 ℃ 85 s；93 ℃ 35 s，62 ℃ 55 s，72 ℃ 50 s，35个循环，最后72 ℃ 7 min。第2轮PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像仪分析结果。产物送上海华大基因科技有限公司进行双向测序。

1.2.5 PCR产物序列分析 利用NCBI网站( https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的局部相似性基本查询工具(basic local alignment search tool,BLAST)对测得的序列进行比对分析，确认序列的可靠性。由于3份DNA样品测得序列完全一致，因此将测序获得的1条代表性特异性片段序列(13271-1)与GenBank中下载的栎树猝死病菌及其近似种的序列用Clustal X软件聚类分析，利用MEGA 6.0软件以邻接法构建系统发育树，以烟草疫霉菌Phytophthoranicotianae和恶疫霉Phytophthoracactorum序列为外群，进行1000次重抽样计算系统树中节点的置信度。

2 结果与分析

2.1 分离情况

在25 ℃下，分离物在PDA平板上生长7 d后，经形态学观察及ITS序列测定后，检出青霉属Penicilliumsp.、曲霉属Aspergillussp.、粘帚霉属Gliocladiumsp.和链格孢属Alternariasp.等真菌的分离物，以腐生菌为主。采用PDA平板分离法，未分离获得栎树猝死病菌分离物。

2.2 寄主植物种类鉴定

利用NCBI网站上的BLAST程序对测得的ITS序列进行比对分析，该寄主植物枝条(图1)的ITS基因序列与GenBank中的壳斗科Fagaceae水青冈属Fagussp.基因序列相似性达99%以上。

图1 德国进境云杉原木及其夹带的水青冈枝条

2.3 栎树猝死病菌特异性引物PCR

用栎树猝死病菌引物对phyto1/phyto4和phyto2/phyto3对样品基因组DNA(编号：13271-1)进行巢式PCR检测，阴性和空白对照无扩增产物，阳性对照和待测样品均扩增得到了约为280 bp的特异性DNA片段(图2)。

图2 特异性引物phyto2/phyto3 PCR检测结果

2.4 序列分析

测定的序列与NCBI中登录号为AY423276、AY423288、AY423289、MF441634、MF441641和NR147877等栎树猝死病菌的ITS序列相似性达99%。系统发育分析结果(图3)显示，供试样品13271-1序列与P.ramorum的模式菌株CBS 101553序列聚为一支(bootstrap值为82)。

图3 基于栎树猝死病菌及近似种类的rDNA ITS序列构建的系统发育树

3 讨论

寄主植物不同，栎树猝死病菌可引起不同症状，造成寄主植物树干溃疡或叶片枯死等症状，进而使寄主植物短时间内死亡。其病原菌可随感病叶片、幼枝、植物苗木和观赏植物进行传播扩散，且植物受到侵染后无有效的防治方法(Brasier & Webber，2010)。目前，栎树猝死病菌的相关寄主已超过150余种，包括森林树木、灌木、草本植物和木本观赏植物等(Parke & Peterson，2019)，且其寄主名单还在不断增加(APHIS，2020)，进境原木中栎树原木Quercusspp.、枫木原木Acerspp.、花旗松原木Pseudotsugaspp.和山毛榉原木Fagusspp.等多个树种均是其自然寄主(国家认证认可监督管理委员会，2008)。进境原木携带栎树猝死病菌风险很高，需要高度重视。

在园艺苗圃中，栎树猝死病菌的传播多发生在相邻的、接触的植物或有地表水相连接寄主植物之间，灌溉水是苗圃间病菌传播的重要来源(Parke & Peterson，2019)。受侵染植物的运输是栎树猝死病菌长距离传播的主要途径，这也是该病菌传入欧洲和北美的原因。自2007年从德国引进的高山杜鹃Rhododendronspp.上首次检出栎树猝死病菌以来(陈小龙等，2007)，该病菌已在上海、宁波、杭州等口岸的意大利、波兰、荷兰等欧洲国家进境种苗上多次被截获(段维军，2019； 段维军等，2017)。从目前我国所截获检疫性菌物的寄主范围来看，栎树猝死病菌的寄主最多，高达67种植物，且均为进境种苗(段维军等，2017)。可见，进境苗木中栎树猝死病菌的检测是口岸植物检疫工作的重点。在进境原木检疫工作中，尽管我国有大量来自欧洲和美国的原木进口，但对于进境原木中栎树猝死病菌的检测重视程度仍不够，鲜有截获报道。同时，由于进境原木搬运掏箱等都较为困难，以往的检疫工作多关注昆虫类有害生物，对菌物类关注较少。70%～80%的植物病害是由菌物所造成的(谢联辉，2006)，进境原木中检疫性菌物的检疫鉴定工作亟待加强。

栎树猝死病菌是一种十分危险的检疫性菌物。据测算，该病菌对美国加利福尼亚州10年间造成的经济损失高达近百亿美元(Kovacsetal.，2011)。已有研究表明，栎树猝死病菌传入我国及其在我国定殖的风险性极高，传入风险性、定殖风险性和潜在的危害严重度均较高(陈培昶和池杏珍，2008)；且在我国的适生区广阔，属于极高风险的有害生物(方舟等，2016； 刘诚和曹春香，2014； 邵立娜等，2008)。林司曦和叶建仁(2020)研究建议，在进境检疫中对其可能寄主植物实施严格检疫及2年以上的隔离试种，防止其进入中国。原木类植物产品不同于种苗，没有隔离程序，其所携带有害生物如果没有经过严格检疫很容易扩散传播，对此需要高度警惕。

本研究通过巢式PCR检测、DNA序列测定确认了自德国进境原木夹带水青冈枝叶携带栎树猝死病菌，但未分离获得栎树猝死病菌菌株，在以往口岸截获中也同样没有成功获得分离株，表明栎树猝死病菌分离较为困难。栎树猝死病菌分离需要采用选择性培养基，且培养温度为20～22 ℃(国家认证认可监督管理委员会，2008)，用PDA进行分离可能是未能成功获得分离株的原因之一。进境欧洲原木需要跨海运输耗时近一个月，进境原木中夹带枝条上的叶片以及枝干均已经干枯，这可能是分离获得菌株以腐生菌为主的原因，也是未能获得栎树猝死病菌分离株的原因之一。在今后口岸检疫工作中，为提高检测效率，可以直接取样制片后在显微镜下检查病菌繁殖结构等是否存在，为后续检测工作开展提供指引。

尽管本研究未能获得分离株，但检测发现样品中有栎树猝死病菌，对阳性扩增产物的DNA测序结果证实了样品中带有栎树猝死病菌。巢式PCR方法具有非常高的灵敏度，由于操作过程中有一个取PCR产物进行二次扩增的步骤，在PCR管开盖过程中会形成气溶胶，非常容易污染，必须仔细操作并设置阳性、阴性和空白对照，以避免假阳性、假阴性的出现。同时，为确认检测结果，建议对扩增产物进行双向测序，DNA序列是各种基于其序列信息所设计检测方法的根本依据，通过序列测定能够从源头确认检测结果。现行栎树猝死病菌检疫鉴定标准判定依据明确指出，如分离菌的形态特征或PCR产物与鉴定指标吻合，可鉴定为栎树猝死病菌(国家认证认可监督管理委员会，2008)。因此,可以判定本次截获病菌为栎树猝死病菌。Wongetal.(2020)建立了针对该病菌关键基因的分子诊断分析技术，通过分析mRNA与gDNA的比率来评估其活力，本次截获栎树猝死病菌活性究竟如何，有待进一步研究。