邱远望，胡贤陈，项雷文，陈文韬，李元明，王茂德

（1.福建中益制药有限公司，福建泉州 362000；2.福建技术师范学院食品与生物工程学院，福建福清 350300）

硫酸阿托品是茄科植物，如颠茄、山莨菪、曼陀罗、洋金花等[1]中的主要活性物质.其中硫酸阿托品作为一种抗胆碱药[2]，具有抗痉止疼、散瞳、解毒等作用[3].硫酸阿托品片、硫酸阿托品滴眼液以及硫酸阿托品注射液是其主要的药品形式，具有广泛的药用市场.颠茄作为民间传统的药用型植物，其全草均具有高含量的托品烷类生物碱[4]，尤以是叶与根的含量最高[5].颠茄草是多年生草本茄科植物，富含硫酸阿托品，因此对颠茄草中硫酸阿托品的提取研究具有实际意义.

乙醇渗滤法[6]是提取硫酸阿托品的传统方法，但该法耗时长，不利于效益的提高；此外，提取硫酸阿托品的常用方法还包括回流法和索式抽提法，但两者都存在溶剂用量大、耗时长等缺点[7].本文采用超声辅助提取颠茄草中的硫酸阿托品，通过对乙醇浓度、超声时间、料液比和粒度4个因素进行工艺优化，并根据正交实验结果确定最优提取工艺，能大大缩短提取时间，降低成本.

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

颠茄草（湖南永州市东安县）；乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸二氢钾（分析纯，西陇化工股份有限公司）；三乙胺（分析纯，西陇科学股份有限公司）；磷酸（分析纯，山东西亚化学股份有限公司）；氨试液（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；硫酸阿托品对照品（中国食品药品检定研究院）；纯净水（自制）.

1.2 仪器设备

高相液相色谱仪（Waters 2695，沃特世），电子天平（TE612-L型，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），旋转蒸发仪（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂），离心机（RC 6+，赛默飞），超声波清洗器（KQ-500DE，昆山超声波仪器有限公司），低温冷却液循环泵（DLSB-10/20，郑州长城科工贸有限公司）.

1.3 实验方法

1.3.1 提取方法

取干燥颠茄草，粉碎，称取颠茄粗粉5.0 g，加入85%的乙醇溶液，超声（功率为300 W）提取30 min，抽滤得到滤液，旋转蒸发至干，加入15 mL氨试液，再加入15 mL乙酸乙酯萃取，离心（5 000 r/min，3 min）取上清液，将上清液旋蒸至干，用乙腈溶解并定容至5 mL，通过高效液相色谱法[8]测定并计算得率.

1.3.2 对照品溶液的制备

将硫酸阿托品对照品在120℃的烘箱中干燥至恒重，精密称取，加乙腈-磷酸盐缓冲液溶解并定容成0.25 mg/mL的溶液，即得.

1.3.3 含量测定

色谱条件 填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液（7∶93）；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL.

1.3.4 单因素实验

1.3.4.1 乙醇浓度 取同一粒度的颠茄粉，按料液比1∶40加入乙醇，乙醇浓度分别为55%、75%、85%、95%，超声提取20 min.通过HPLC法测定不同乙醇浓度下硫酸阿托品的提取率.

1.3.4.2 超声时间 取同一粒度的颠茄粉，按料液比1∶40加入85%的乙醇溶液，分别超声提 取10、20、30、40、50 min.通 过HPLC法测定不同提取时间下硫酸阿托品的提取率.

1.3.4.3 料液比 取同一粒度的颠茄粉，按不同料液比（1∶10、1∶30、1∶40、1∶50、1∶100）加入85%的乙醇溶液，超声提取40 min.通过HPLC法测定不同料液比下硫酸阿托品的提取率.

1.3.4.4 粒度 取不同粒度（10、24、50目）的颠茄粉，按料液比1∶50加入85%的乙醇溶液，超声提取40 min.通过HPLC法测定不同粒度下硫酸阿托品的提取率.

1.3.5 正交实验

通过正交实验优化颠茄中硫酸阿托品的提取工艺，在单因素实验的基础上，选取乙醇浓度、超声时间、料液比以及粒度作为考察的主要因素，以测得的硫酸阿托品的含量为指标，采用3水平4因素，按照L9（34）正交设计进行优化实验，实验因素水平见表1.

表1 工艺优化正交实验因素与水平表

2 结果与分析

2.1 对照品与颠茄草提取物高效液相色谱图

硫酸阿托品对照品与颠茄草提取物的高效液相色谱如图1、图2所示.

图1 硫酸阿托品对照品高效液相色谱图

由图1可知，在此色谱条件下，硫酸阿托品的出峰时间在30.250 min，并与其他杂质峰实现基线分离；且从图2中可以看出，颠茄草提取物中除硫酸阿托品外，仅有少量杂质峰，纯度较高；硫酸阿托品的出峰时间受杂质影响，出峰时间前移至29.906 min，与杂质峰也实现了基线分离，表明硫酸阿托品用高效液相色谱分离测定是可行的.

图2 颠茄草提取物高效液相色谱图

2.2 单因素实验结果

2.2.1 不同乙醇浓度对颠茄草中硫酸阿托品提取率的影响

乙醇浓度对颠茄草中硫酸阿托品提取率的影响如图3所示.

由图3可知，在乙醇浓度为55%时得率最低，随着乙醇浓度的增加，硫酸阿托品的含量呈增长趋势，乙醇浓度为85%时硫酸阿托品的提取率最高，达到0.56 mg/g；乙醇浓度再升高时，提取率反而降低.产生这种先增高后降低的原因可能与颠茄草中硫酸阿托品的极性有关，在较低或较高的乙醇溶液中，硫酸阿托品都不能完全溶解出来，适当浓度的乙醇水溶液，可以通过相似相容原理最大化地提取颠茄草中的硫酸阿托品.因此选择75%、85%和95%乙醇浓度做正交实验.

图3 乙醇浓度对硫酸阿托品提取率的影响

2.2.2 不同超声时间对颠茄草中硫酸阿托品提取率的影响

超声提取时间对颠茄草中硫酸阿托品提取率的影响如图4所示.

由图4可知，将超声作为辅助提取方式，显著增加了颠茄草中硫酸阿托品的提取率，这是因为超声可破坏细胞壁，使颠茄枝叶细胞中的硫酸阿托品更易溶出，从而提高提取率.而随着超声时间的增加，硫酸阿托品的含量呈增长趋势，超声时间在40 min时，硫酸阿托品的提取率最高，质量比 0.59 mg/g，当到50 min时，硫酸阿托品含量略微下降，这可能是因为随着时间的延长，颠茄草中其它可溶性成分溶出，增大溶液的粘稠度，抑制了硫酸阿托品的溶出；此外，时间太长，硫酸阿托品的结构可能遭到破坏.由于10 min和20 min时，提取率较低，因此选择30、40、50 min作为正交实验的参数较合适.

图4 提取时间对硫酸阿托品提取率的影响

2.2.3 不同料液比对颠茄中硫酸阿托品提取率的影响

在前两个单因素实验的基础上，使用体积分数为85%的乙醇，超声时间40 min，改变料液比，对颠茄草中硫酸阿托品提取率的影响如图5所示.

图5 料液比对硫酸阿托品提取率的影响

由图5可知，随着料液比的下降，硫酸阿托品提取率的含量呈增长趋势，这是由于物料与溶剂的接触更加充分，使乙醇与超声的效益最大化，增大硫酸阿托品的溶出；此外，浓度差亦是提高得率的一个重要原因.当料液比在1∶50时硫酸阿托品含量为0.56 mg/g，而当继续增加料液比时，硫酸阿托品含量基本不再增加，说明提取效率已达到最大化.考虑到成本的问题，选用1∶40、1∶50和1∶60进行正交实验为宜.

2.2.4 不同粒度对颠茄中硫酸阿托品提取率的影响

将颠茄草分别过10目、24目和50目筛，再使用乙醇浓度85%，超声时间40 min，料液比1∶50进行提取，粒度对颠茄中硫酸阿托品提取率的影响如图6所示.

由图6可知，颠茄粒度越小，硫酸阿托品的提取率越高，过50目筛时，硫酸阿托品的提取率为0.60 mg/g，这是因为粉碎不仅可以破坏细胞，还可以增大物料与溶剂的接触面积，从而提高得率；但是粒度太小将对过滤除杂等过程造成一定影响，因此并非粒度越小越好.在正交实验中，同样采用10目、24目和50目筛为优化条件.

图6 粒度对硫酸阿托品提取率的影响

2.3 正交实验

按照表1中工艺优化正交实验因素与水平进行正交实验，结果见表2，方差分析结果见表3.

由表2可知，颠茄草中硫酸阿托品的最佳提取工艺组合为A2B1C2D3，即乙醇浓度为85%，超声时间30 min，料液比为1∶50，过50目筛，在此工艺提取下，每克颠茄草中能提取0.61 mg的硫酸阿托品.

表2 正交实验结果

而由表3的方差结果可知，超声提取颠茄草中硫酸阿托品各因素的影响顺序为D ＞ A = B ＞ C，即粒度 ＞ 乙醇浓度 = 超声时间 ＞ 料液比，由此说明粉碎过筛工序在颠茄草中硫酸阿托品提取工艺中的必要性，乙醇浓度与超声时间次之，料液比对提取率的影响最低.

表3 方差分析结果

3 结论

通过单因素实验，研究乙醇浓度、超声时间、料液比以及粒度对超声提取颠茄草中硫酸阿托品提取率的影响，以单因素的实验结果为基础，采用正交实验优化工艺，得到的最佳工艺：将颠茄草粉碎，过50目筛，按照1∶50的料液比加入85%的乙醇溶液，超声提取30 min.在该工艺条件下，硫酸阿托品的提取率为0.61 mg/g，并得到粒度是影响提取率最大的因素，为颠茄草中硫酸阿托品的提取提供参考价值.