安丹丹 代应贵 韩雪

摘要：【目的】从分子水平揭示珠江水系都柳江小口白甲鱼种群遗传结构和多样性的特点，探讨其致危原因及机制，为开展小口白甲鱼种群保护提供科学依据。【方法】于贵州境内都柳江三都、兴华和榕江3个采样点共采集30尾小口白甲鱼，筛选8个引物组合对都柳江小口白甲鱼种群全基因组DNA进行AFLP分析，采用PopGene32进行位点总数和多态位点数统计，并计算Shannons信息指数（I）、Nei基因多样性指数（H）、多态信息含量（PIC）、观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）及个体遗传距离（DA）等遗传参数。【结果】采用8个引物组合从都柳江小口白甲鱼种群中共扩增出699条扩增片段，片段长度为69～500 bp，平均每个引物组合扩增获得87.38个位点。在699个扩增位点中，有663个位点为多态位点，多态位点数占总位点数的94.85%。699个扩增位点在30尾都柳江小口白甲鱼个体中的出现频率可划分为10个区间，其中，频率区间30%～89%的扩增位点数差异不明显，而频率区间0～9%和90%～99%的扩增位点数出现峰值。都柳江小口白甲鱼种群的I、H、PIC、Na、Ne平均值分别为0.3490、0.2206、0.6404、1.9464和1.3574，個体间的DA为0.2305～0.4440，平均为0.3304;基于DA构建的都柳江小口白甲鱼种群UPGMA系统进化树显示，30尾都柳江小口白甲鱼聚成两大分支，即个体18单独聚为一个分支，而其余29尾都柳江小口白甲鱼个体聚为另一分支。【结论】都柳江小口白甲鱼种群遗传多样性丰富，但存在有效种群规模变小及有效等位基因丢失的现象，推测其为生态濒危物种，应采取相关措施对都柳江小口白甲鱼种群进行科学保护。

关键词： 小口白甲鱼;群体遗传多样性;AFLP分析;多态位点;都柳江

中图分类号： S965.199                           文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）08-2294-08

AFLP analysis of genetic diversity in population of vulnerable species Onychostoma lini from Duliu River

AN Dan-dan1， DAI Ying-gui1，2*， HAN Xue1

（1College of Animal Sciences， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2Special Fisheries

Research Institute， Guizhou University， Guiyang 550025， China）

Abstract：【Objective】To clarify the genetic structure and diversity of Onychostoma lini population from the Duliu River in the Pearl River system， and explore the endangered mechanism， and provide reference for protection countermeasures of the species. 【Method】The genetic diversity of whole genome DNA in the 30 individuals of O. lini collected in the river in Sandu， Xinghua and Rongjiang of Guizhou was analyzed by the methods of AFLP using 8 selected primer pairs， the parameters for genetic diversity including total number of amplified locus， number of amplified polymorphic locus， Shannons information index（I）， Neis gene diversity index（H）， polymorphism information content（PIC）， number of observed allele（Na）， number of effective allele （Ne） and genetic distance（DA） were calculated by PopGene32. 【Result】A total of 699 amplification fragments comprising 69-500 bp respectively were amplified using the 8 primer pairs. On average， 87.38 sites were obtained for each primer combination amplification. Among the 699 amplification sites，  663 were polymorphic loci accounting for 94.85% of the total. The 699 amplified loci were distributed in 10 intervals of occurrence frequency of locus in the 30 individuals of O. lini from the Duliu River. Of them， the number of amplified locus changed slightly in interval of occurrence frequency of 30%-89% but those in intervals of occurrence frequency of 0%-9% and 90%-99% both occurred peak values. The values of I， H， PIC， Na and Ne in the population averaged   0.3490， 0.2206， 0.6404， 1.9464 and 1.3574， respectively. The DA of the 30 individuals ranged from 0.2305 to 0.4440， with an average of 0.3304. The UPGMA phylogenetic tree of the population based on DA  showed that，  the 30 individuals was clustered into 2 branches based on the genetic distance， 18 individuals was clustered into a branch and the rest 29 into another. 【Conclusion】The population of O. lini from the Duliu River contained high genetic diversity， but the effective population size had become small and some effective alleles had been lost in the population， and therefore O. lini might be an ecologically endangered species. It is necessary to take measures to protect the O. lini population in the Duliu River.

Key words： Onychostoma lini; population genetic diversity; AFLP analysis; polymorphic site; Duliu River

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（30760189，30960297）; Scientific and Technological Project of Guizhou（QiankeheJ〔2007〕2062）

0 引言

【研究意义】小口白甲鱼（Onychostoma lini）隶属于鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）鲃亚科（Barbinae）白甲鱼属（Onychostoma），主要分布在我国沅江水系、汀江、九龙江及珠江下游水系，为淡水名优野生经济鱼类（代应贵等，2010）。近年来，受人类活动的影响，小口白甲鱼野生资源濒临枯竭，已被列为易危鱼类（汪松和解焱，2004）。在贵州境内，小口白甲鱼仅残存分布于长江水系清水江和珠江水系都柳江部分河段（代应贵和陈毅峰，2007），其种群数量非常稀少。遗传多样性是指种内不同群体或同一群体内不同个体遗传变异的总和，是生物多样性的基础（陈灵芝，1993）。种群遗传多样性是评价物种在自然压力下生存能力的重要指标（Erickson et al.，2004）。在物种适应生存环境变化的过程中，低水平的遗传多样性常伴随着杂合度降低和近交衰退，进而制约种群对环境变化的适应能力和进化潜力，增加种群灭绝的风险（Erickson er al.，2004;佟广香等，2009;施雯等，2010）。开展生物种群遗传多样性研究不仅可揭示物种进化的历史，还能为进一步分析其进化潜力和未来命运提供证据，尤其有助于对物种稀有或濒危原因及其过程进行探讨（陈珊珊和周明芹，2010）。因此，检测和评估受威胁鱼类种群遗传多样性，可分析其自然生境适应能力并揭示致危原因和机制，进而提出科学的保护策略。【前人研究进展】扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）是荷兰科学家于1995年提出研究群体遗传变异的成熟分子标记技术，具有所需DNA量少、可重复性好、多态性检测灵敏及无需了解其遗传背景等优点（李秀诗等，2019;廖秋石等，2020）。该技术是基于限制性酶切和PCR的全基因组DNA扩增片段长度多态性检测方法，克服了限制性片段长度多态性（RFLP）复杂和随机扩增多态性DNA标记（RAPD）稳定性差的缺点，但保留了RFLP重复性高及PCR简便快捷等优点（马召腾和潘连德，2011）。韩志强等（2007）采用AFLP、RAPD及Cytb基因序列分析等3种方法研究半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）群体的遗传变异，结果表明AFLP分子标记对群体遗传变异的检測较其他2种方法更灵敏。近年来，AFLP分子标记更多应用于水产动物群体遗传结构及多样性分析（Sharifi et al.，2015;孙苗苗等，2017;Napora-Rutkowski et al.，2017;刘良国等，2018）。陈见等（2014）采用AFLP分子标记对翘嘴鲌（Erythroculter ilishaeformis，♀）、黑尾近红鲌（Ancherythroculter nigrocauda，♂）及其杂种F1群体进行遗传差异分析;Sharifi等（2015）采用AFLP分子标记研究波斯湾对阿巴斯、布什尔和阿巴丹近岸海域乌鲹（Parastromateus niger）3个群体的亲缘关系和系统进化，结果表明这3个波斯湾乌鲹群体分属不同种群;刘祥芳等（2017）基于AFLP技术在太湖野生翘嘴鲌群体中筛选出雌、雄性个体的特异分子标记，并进行性别连锁基因及其转换标记研究;闫学春等（2018）利用AFLP分子标记证实外源基因组DNA可通过显微注射方式整合到鲫（Carassius auratus）的基因组中，从而获得转基因鲫。【本研究切入点】小口白甲鱼为我国特有鱼类和重要经济鱼类，但该物种正面临着种群数量减少和分布区急剧缩小的趋势，且有关小口白甲鱼分子标记或多态性的研究报道极少，仅见代应贵等（2010）采用DNA测序技术对都柳江小口白甲鱼种群进行mtDNA D环序列变异及遗传多样性分析。因此，从不同角度对都柳江小口白甲鱼种群的遗传多样性进行系统评估，进而开展其野生种群的恢复与保护显得十分迫切。【拟解决的关键问题】应用AFLP分子标记基于全基因组进行珠江水系都柳江小口白甲鱼种群遗传变异分析，从分子水平揭示其种群遗传结构和多样性的特点，探讨小口白甲鱼致危原因及机制，为开展小口白甲鱼种群保护提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 样品采集及全基因组DNA提取

供试都柳江小口白甲鱼以刺网采自贵州境内都柳江三都至榕江河段（图1），在三都、兴华和榕江3个采样点分别采集5、10和15尾，共计30尾。都柳江小口白甲鱼捕获后解剖取其肌肉样品，并以乙醇保存备用。肌肉样品采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒[DP324-02，天根生化科技（北京）有限公司]进行全基因组DNA提取。

1. 2 AFLP分析

AFLP分析所用的接头和引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，限制性内切酶EcoR I（B300140-0005）/Mse I（B300224-0300）、T4 DNA连接酶（B600511-0002）、dNTP（B300576-0200）、Taq DNA聚合酶（B600001-0200）及10×Buffer（B300048-0005）也购自生工生物工程（上海）股份有限公司。经预试验筛选出8个引物组合（表1）对都柳江小口白甲鱼种群全基因组DNA进行AFLP分析。

1. 2. 1 限制性酶切与连接反应  酶切反应体系20.0 μL：DNA模板4.0 μL，Adapter 1.0 μL，EcoR I/Mse I 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L ATP 2.5 μL，T4 DNA连接酶1.0 μL，ddH2O 7.0 μL，混匀后离心数秒。酶切程序：37 ℃ 5 h，8 ℃ 4 h，4 ℃过夜。以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

1. 2. 2 预扩增 PCR反应体系25.0 μL：DNA模板 2.0 μL，PreAmp Mix（预扩引物）1.0 μL，dNTPs 1.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 18.0 μL，混匀后离心数秒。扩增程序：94 ℃预变性2 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，进行30个循环;72 ℃延伸5 min。以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测预扩增产物。

1. 2. 3 选择性扩增 预扩增产物按1∶20稀释后作为扩增模板。PCR反应体系25.0 μL：预扩增产物稀释样品2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，EcoR I/Mse I各1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL，混匀后离心数秒。扩增程序：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s;再进行12个循环，每个循环的退火温度递减0.7 ℃;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，进行23个循环。PCR扩增产物4 ℃保存备用。

1. 2. 4 电泳 采用贝克曼库尔特公司的CEQ8000遗传分析系统，运用荧光标记和毛细管电泳分离技术，将PCR扩增产物在毛细管中进行电泳分离，以激光激发荧光采集数据，电泳结果通过CEQ8000遗传分析系统自带软件自动统计分析并转换成“0，1”矩阵，保存于Excel表格供数据处理。

1. 3 数据处理

采用PopGene32进行位点总数和多态位点数统计，计算Shannons信息指数（I）、Nei基因多样性指数（H）、观测等位基因数（Na）和有效等位基因数（Ne）等遗传参数。根据公式PIC=∑（1-Pi2）/n计算多态信息含量（PIC），其中Pi为任一引物组合扩增获得第i条条带在所有供试材料中出现的频率;参照Nei等（1983）的方法计算个体间的遗传距离（DA），并基于DA采用MEGA 6.0构建都柳江小口白甲鱼种群UPGMA系统进化树。

2 结果与分析

2. 1 都柳江小口白甲魚种群AFLP扩增结果

经预试验筛选，选择8个引物组合（表1）对都柳江小口白甲鱼基因组进行扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测获得多态性丰富、成像清晰而稳定的电泳条带，即AFLP扩增图谱（图2）。

采用8个引物组合对都柳江小口白甲鱼种群（30尾）基因组进行扩增，共获得699条扩增片段，片段长度为69～500 bp（表2）。每个引物组合扩增获得的片段数在54～121条，平均为87.38条。以引物组合8得到的扩增片段数最少（54条），而引物组合2得到的扩增片段数最多（121条）。每个引物组合扩增获得的基因型数在29～30个，平均为29.50个。

2. 2 都柳江小口白甲鱼种群遗传多样性分析结果

在都柳江小口白甲鱼种群中，8个引物组合共扩增出699个位点，平均为87.38个位点（表3）。在699个扩增位点中，有663个位点为多态位点，多态位点数占总位点数的94.85%。8个引物组合的多态位点数在50～111个，多态位点比例为86.30%～98.91%，平均为94.64%。以引物组合5扩增获得的多态位点数最多（111个），而引物组合8扩增获得的多态位点数最少（50个）;引物组合4扩增获得的多态位点比例最高（98.91%），而引物组合2扩增获得的多态位点比例最低（86.30%）。8个引物组合扩增的共有位点数为1～10个，平均为4.50个。都柳江小口白甲鱼种群的I、H、PIC、Na、Ne平均值分别为0.3490、0.2206、0.6404、1.9464和1.3574（表3）。

699个扩增位点在30尾都柳江小口白甲鱼个体中的出现频率可划分为10个区间：0～9%、10%～19%、20%～29%、30%～39%、40%～49%、50%～59%、60%～69%、70%～79%、80%～89%、90%～99%和位点频率为100%的关键点（图3）。其中，频率区间30%～89%的扩增位点数差异不明显，而频率区间0～9%和90%～99%的扩增位点数出现峰值。

2. 3 都柳江小口白甲鱼种群的聚类分析结果

30尾都柳江小口白甲鱼个体间的DA为0.2305～0.4440，平均为0.3304。基于DA构建的都柳江小口白甲鱼种群UPGMA系统进化树（图4）显示，30尾都柳江小口白甲鱼聚成两大分支。其中，个体18单独聚为一个分支，而其余29尾都柳江小口白甲鱼聚为另一分支。

3 讨论

遗传多样性可反映种内遗传变异水平，是衡量种群生存、进化及其对环境条件适应的关键指标（陈灵芝，1993）。丰富的遗传多样性决定了物种的进化潜力及适应环境变化的能力，有助于保持物种和整个生态系统的多样性（陈珊珊和周明芹，2010）。多态位点比例是评价群体遗传多样性的特征参数（佟广香等，2009）。若群体中同一引物组合扩增多态位点数占总位点数的比例超过50%，即认为该群体具有较丰富的遗传多样性（陈良华等，2009）。本研究以筛选出的8个引物组合对都柳江小口白甲鱼种群进行AFLP扩增，获得的多态位点数占总位点数的86.3%～98.91%，平均为94.64%，显著高于长江合江江段的岩原鲤（Procypris rabaudi）群体（37.50%～68.57%）（宋君等，2005）和黑龙江水系呼玛河的野生哲罗鱼群体（43.64%～55.64%）（佟广香等，2009），也高于洞庭湖库区（85.41%）和沅水下游（83.25%）的黄颡鱼（Pelteobagrus nitidus）群体（刘良国等，2018），表明都柳江小口白甲鱼种群具有较丰富的遗传变异。I 和H是反映群体遗传变异的常用指标，其数值越高则表明遗传变异越大，群体遗传多样性越高（佟广香等，2009）。本研究中，都柳江小口白甲鱼种群的I为0.2862～0.3969（平均为0.3490），H为0.1713～0.2585（平均为0.2206），分别高于黑龙江水系呼玛河哲罗鱼群体（I=0.2215，H=0.1480）（佟广香等，2009）、乌苏里江尖吻细鳞鲑（Brachymystax lenok）群体（I=0.1985，H=0.1364）（王荻等，2010）及鲢（Hypophthalmichthys molitrix）长江水系邗江群体、老河群体、珠江群体和黑龙江群体（I=0.0784～0.1051，H=0.0481～0.0661）（严骏骢等，2010）等，进一步说明都柳江小口白甲鱼种群具有较高的遗传多样性。当PIC≥0.50时扩增位点为高度多态性位点，0.25

Na与Ne间的差异越小，表明该等位基因在群体内分布的均匀度越高（戴习林等，2017）。都柳江小口白甲鱼种群的Na在1.8630～1.9891，平均为1.9464;Ne在1.2645～1.4326，平均为1.3574，即Na明显高于Ne，表明该种群中等位基因分布的均匀度较低，存在有效种群规模变小且有效等位基因丢失的现象。都柳江蕴藏着丰富的水力资源，其干流自三都以下河段现已规划17级航电开发枢纽（曹孟智，2016），其中在榕江县、三都县境内分别修建的永福电站（赵景志等，2016）和白梓桥电站已实现截流发电，水电站大坝的修建对坝址上下游河段产生了阻隔效应，导致其水域生境片段化，阻断了小口白甲鱼的洄游路径。这可能是导致都柳江小口白甲鱼有效种群规模变小、有效等位基因丢失的主要原因。濒危物种、狭窄物种和特有物种的种群普遍处于较低的遗传多样性水平（Ellstrand and Elam，1993）。小口白甲鱼已被列为易危物种（汪松和解焱，2004），但本研究结果表明都柳江小口白甲鱼种群仍保存着较丰富的遗传多样性，故推测都柳江小口白甲鱼属于生态濒危物种，因此建议采取有针对性的对策积极开展其种群资源保护：（1）保护都柳江河流生境，对河流沿岸村庄、集镇、县城进行垃圾无害化处理和污水处理，防止对都柳江造成水质污染，以满足小口白甲鱼对栖息水域水质的要求;（2）在都柳江开展水利工程建设时须进行环评论证，确保不会对小口白甲鱼种群造成负面影响，如建设水电站大坝时应修建过鱼通道等配套工程以免阻断小口白甲鱼的洄游路径;（3）加大对都柳江小口白甲鱼种群的保护力度，实行禁渔期、禁渔区制度，严格执法，最大限度地减小人为捕捞的影响;（4）对野生小口白甲鱼进行人工驯养繁殖试验，积极开展小口白甲鱼人工增殖放流;（5）开展都柳江小口白甲鱼种群动态监测及保护生物学研究。

进行群体遗传学评价时，样本充分采集是准确评估群体遗传结构的前提条件，检测样本量及分子标记的选用直接影响遗传评估效率（戴习林等，2017）。在珍稀濒危鱼类种群遗传学研究中，常因种群数量稀少而无法采集到较大数量的试验样本。Sj?gren和Wy?ni（1994）通过计算机模拟运算发现，样本量和等位基因位点数过少会导致检测群体遗传变异偏低，甚至检测不到变异。李思发（1998）应用同工酶技术进行淡水鱼类种质资源研究时发现，供试群体样本量应大于30尾。张继全等（1998a，1998b）基于计算机模拟和中国黄牛（Bos taurus）品种实例分析，认为基因位点数和样本量是影响群体遗传距离估测精度的主要因素。刘丽等（2005）通过对40尾勒氏笛鲷（Lutjanus russellii）的DNA进行RAPD分析，结果发现调查样本量应达20尾且位点数应达70个才能保证研究结果的可靠性。戴习林等（2017）对罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）种群的SSR分析也显示样本量及分子标记量对种群遗传多样性指标有显著影响，而性别对群体遗传多样性指标无显著性影响，当样本量大于30尾、分子标记位点数大于25个时，群体各遗传参数值趋于稳定。

AFLP是一种成熟的种群遗传多样性检测方法，其技术要求用于群体遗传多样性分析的样本量要足够多，然而在实际操作中受研究规模、经费和时间限制、可供分析基因位点的丰富性及标本样品可获得性等因素的影响，常导致用于研究的群体样本量只能维持在一定水平。周艺彪等（2005）对湖北钉螺（Oncomelania hupensis）种群遗传多样性的AFLP分析结果表明，当试验样本量超过30只、基因位点总数超过338个时，其种群遗传多样性指标值趋于稳定。由于水域生境破坏及人为过度捕捞的影响，小口白甲鱼在都柳江目前仅残存分布于三都至榕江江段，种群数量极少。本研究在三都至榕江河段不同采集点共计采集30尾小口白甲鱼，通过AFLP技术标记出669个基因位点，其研究结果能反映该种群遗传多样性水平的现状，具有较高的可信度。由于群体遗传多样性的准确测定受样本量、扩增位点数及分子标记等多种因素的影响（周艺彪等，2005;戴习林等，2017），因此今后可通过增加样本量、扩增位点数及采用其他分子标记对都柳江小口白甲鱼种群遗传多样性进行更深入的研究。

4 结论

都柳江小口白甲鱼种群遗传多样性丰富，但存在有效种群规模变小及有效等位基因丢失的现象，推测其为生态濒危物种，应采取相关措施对都柳江小口白甲鱼种群进行科学保护。

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（責任编辑 兰宗宝）

收稿日期：2020-07-28

基金项目：国家自然科学基金项目（30760189，30960297）;贵州省科学技术基金项目（黔科合J字〔2007〕2062）

通讯作者：代应贵（1968-），https：//orcid.org/0000-0001-6104-7671，教授，主要从事水产生物种质资源研究工作，E-mail：daiygui@163.com

第一作者：安丹丹（1995-），https：//orcid.org/0000-0002-2674-0889，研究方向为水产动物种质资源学，E-mail：2479277157@qq.com