邓仲元，贺星，周新强，郑甦

（深圳市中西医结合医院骨科，广东 深圳 518104）

0 引言

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种临床上最常见的骨关节疾病，随着年龄增长，免疫机能退化，预期寿命增加，本病发病率呈逐年上升的趋势[1,2]。研究显示，各种因素造成关节软骨损伤，也会引发自体抗原和损伤，导致无菌炎症的产生，进一步损伤关节软骨，在膝关节内产生缓慢、持续、渐进的炎症，炎症在KOA 发病的进程发挥重要的角色[3]。临床上治疗KOA 的目标主要是控制症状，减轻疼痛，改善膝关节功能，改善生活质量。治疗方法有保守治疗，如宣传教育、下肢功能锻炼、物理治疗、药物等；有手术治疗，如保膝手术、单髁置换术、全膝关节置换术。从45 岁到60 岁，肠道菌群的具体结构发生了变化。在60～80 岁趋于相对稳定，超过80 岁其菌群结构再次发生变化，其结构组成和多样性的改变在许多慢性疾病的发生发展过程中起着重要的作用[4]。Toll 样受体4 是Toll 样受体（TLR）家族成员之一，其可通过相关信号通路介导炎性反应[5]。白介素1（IL-1）和白介素18（IL-18）是白介素家族成员，均是促炎症因子，参与炎性反应和组织修复。但是，肠道菌群的群落在KOA 患者是否有变化，是否与炎症反应存在相互作用的关系，目前尚不十分清楚。为此，作者探讨KOA 患者TLR4、IL-1、IL-18 的表达关系，肠道菌群的变化，以及两者是否存在相关性，为KOA 患者的诊疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 一般情况

研究病例来自2017 年1 月至2019 年12 月在深圳市中西医结合医院骨科治疗的慢性膝关节疼痛病史、X 线检查并结合临床表现初次确诊膝关节炎患者74 例的完整临床资料，为实验组，男性31 例，女性43 例，年龄40～85 岁，平均年龄(71.0±7.5)岁。对照组为同期在我院进行体检的年龄大于50 岁的自愿参与本研究的健康人50 例，男性20 例，女性30例，年龄41～86 岁，平均年龄(70.0±7.9)岁。两组对象性别、年龄、体重指数、空腹血糖、饮食情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）。本研究经过医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.1.2 纳入标准

（1）实验组患者的诊断符合膝关节骨性关节炎诊断标准。（2）X 线片表现为：非对称性膝关节间隙变窄，软骨下骨硬化，囊性变，关节边缘见骨赘形成。MRI 检查提示膝关节软骨变薄，半月板损伤，关节腔积液等。（3）Kellgren-LawrenceⅠ～Ⅳ级。（4）自愿参与本研究，并签署告知同意书。

1.1.3 排除标准

（1）既往膝关节手术史，糖尿病及其他肠道菌群的疾病，服用抗生素等可能影响肠道菌群的药物。（2）膝关节肿瘤、结核、化脓性炎，类风湿性关节炎、强直性脊柱炎及心脑肺肾等严重病变者。（3）膝关节交叉韧带断裂者。（4）不愿意参与本研究者。

1.2 方法

1.2.1 血清TLR4、IL-1、IL-18 检测

抽取所有研究对象清晨空腹肘部静脉血5mL，送至检验科,采用酶联免疫吸附法检测TLR4、IL-1、IL-18 水平。

1.2.2 肠道菌群的检测

采集两组研究对象自然排出的新鲜粪便约6g，置入密闭无菌容器内，0.5h 内送检中心实验室。称取粪便2g，其余置于-80℃超低温冰箱内保存。提取样本总NDA，用琼浆糖凝胶电泳检测提取DNA 的基因组的完整性。选择10000 个高质量的16srRNA 扩增子序列进行分析，1 个患者因粪便DNA含量低被排除。所有的样本的16S rDNA 的V3-V4 区进行PCR 扩增，送至北京诺禾科技公司进行高通量测序。得到有效序列后进行聚类分析，得到各样本类别信息，进而得到各类别丰度和均匀度信息，对两组人群粪便标本中的肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌、梭菌、总菌数进行培养计数和鉴定。

1.3 统计方法

采用SPSS 22.0 软件。符合正态分布的计量资料以均值±标准差（±s）表示，两组之间比较采用t检验；非正态分布的连续变量以中位数（四分位数）表示，两组之间比较采用非参数检验。计数资料以百分率（%）表示，两组之间比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组血清TLR4、IL-1、IL-18 检测结果

实验组血清TLR4 显著高于对照组，IL-1、IL-18 低于对照组（实验组血清TLR4 高于对照组，IL-1、IL-18 低于对照组（109.31±22.09）ng/L vs（66.80±6.02）ng/L，（88.55±0.89）pg/mL vs（110.29±20.98）pg/mL, （210.24±22.4）pg/mL vs（345.56±43.62）pg/mL,P<0.05。见表1。

表1 两组血清TLR4、IL-1、IL-18 检测结果(±s)

表1 两组血清TLR4、IL-1、IL-18 检测结果(±s)

注：*与对照组比较，P<0.05

组别 例数 TLR4（ng/L） IL-1(pg/mL) IL-18(pg/mL)实验组对照组74 50 109.31±22.09*66.80±6.02 88.55±0.89*110.29±20.98 210.24±22.4*345.56±43.62 tP 28.387 0.000 20.165 0.000 15.951 0.000

2.2 两组肠道菌群结果的比较（M，lg copies/g 粪便）

实验组与对照组比较，双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、梭菌、总菌数比较差异均有统计学意义（8.51±0.56）vs（9.89±0.40），（8.91±0.43）vs（9.69±0.33），（8.96±0.36）vs（8.05±0.31），（8.51±0.42）vs（8.01±0.24），（7.96±0.16）vs（7.09±0.19），（9.16±0.06）vs（9.68±0.87），（8.02±0.24）vs（9.02±0.66）。P<0.05，见表2。

表2 两组肠道菌群结果的比较（M， lg copies/g 粪便）

2.3 实验组患者 TLR4、IL-1、IL-18 与肠道菌群的Pearson 相关性分析

经过Pearson 相关性分析，实验组患者TLR4 与双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌、总菌值呈负相关（P<0.05），与肠杆菌、肠球菌、梭菌呈正相关（P<0.05）；IL-1、IL-18 与双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌、总菌值呈正相关（P<0.05），与肠杆菌、肠球菌、梭菌呈负相关（P<0.05），见表3。

表3 实验组研究对象TLR4、IL-1、IL-18 与肠道菌群的Pearson 相关性分析

2.4 实验组患者肠道菌群的logistic 回归分析

以总菌数为自变量，TLR4、IL-1、IL-18 为因变量，进 行logistic 回归分析发现，TLR4、IL-1、IL-18 是实验组患者总菌数的影响因素。结果见表4。

表4 实验组患者肠道菌群的logistic 回归分析

3 讨论

膝关节骨关节炎（KOA）被认为是全球范围内致残的主要原因，关节软骨的退变性疾病，后期导致严重的疼痛和关节功能丧失[6]。由于人类平均寿命的延长以及饮食习惯和生活方式的改变，其患病率也在不断增加。许多因素可以促进KOA 的发生发展，肠道菌群近来已成为KOA 起始和发展的重要致病因素。遗传，年龄，性别，饮食，生活方式和社会经济方面是影响机体肌肉骨骼健康以及肠道菌群平衡的重要因素。通过产生大量各种各样的生物活性小分子，肠道菌群可以向肠外器官发出信号，与宿主的代谢、内分泌、免疫和肌肉骨骼系统建立复杂的联系。肠道菌群的生物多样性和菌群功能的异常，也称作肠道菌群失调，很可能与炎症有关，炎症是KOA 发展的最主要危险因素之一。膝关节骨性关节炎患者的代谢异常表现为慢性低度全身性炎症的持续存在[7]。KOA不仅是关节软骨的退变，而且是各种炎症因子共同参与的代谢性疾病，其特点是软骨合成降解因子水平降低、促合成因子水平增高，而炎症因子水平紊乱是该病发展的重要推动因素[8]。Boer, CG 等认为巨噬细胞介导的炎症在骨关节炎相关的疼痛和严重程度中有因果作用，并且由肠道菌群产生的内毒素引发的，认为肠道菌群是膝关节炎疼痛可能的靶向治疗目标[9]。

Toll 样受体(toll-like receptor,TLR) 作为模式识别受体的关键成分之一，在先天免疫系统中起着关键作用。Toll 样受体4(TLR4)是TLR 家族成员，在机体的各种细胞和组织均有表达，能识别病原体，激活一系列免疫应答，是外周血单核细胞抗感染的重要组成部分[10]，影响肠道菌群环境，对人体肠道内的多种微生物产生作用。KOA 患者肠道菌群的变化很可能与TLR4 及其信号转导通路存在一定的联系。研究表明IL-1、IL-18 均是骨关节炎的主要细胞因子，刺激介导前列腺素以及胶原酶、中性蛋白酶等软骨降解酶的合成和分泌，从而导致膝关节滑膜炎和关节面软骨破坏。IL-1、IL-18 是由软骨细胞、巨噬细胞等多种细胞产生的,是引起骨关节炎发病的主要因素[11,12]。人体肠道内的大部分细菌定植于人体结肠内，其对宿主的健康与营养起着重要作用，是激活和维持肠道生理功能的关键因素。如果患者肠道出现菌群失调，必将触发机体炎症反应，包括全身性和局灶性炎症反应，参与KOA的发生、发展。

本研究显示，与对照组进行比较，实验组患者肠道菌群中，双歧杆菌、乳杆菌、梭菌数量减少，而肠杆菌、肠球菌、拟杆菌数量增加，总菌值也相应减小。膝关节炎患者经历慢性反复长期的炎症因子刺激后，肠道微生态失衡，肠道细菌发生异位[13]。肠道菌群随着患者年龄增长发生变化，患者的肠道免疫功能低下等[14]。当机体受到外界环境、饮食及用药等因素影响时，肠道中的肠杆菌、肠球菌、拟杆菌等条件致病菌可有机会转为致病菌，破坏机体正常的生理平衡，使得肠道微生态失调[15]。经过Pearson 相关性研究，KOA 患者TLR4 与与 双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、总菌呈负相关（P<0.05），与肠杆菌、肠球菌、梭菌呈正相关（P<0.05）；IL-1、IL-18 与双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、总菌呈正相关（P<0.05），与肠杆菌、肠球菌、梭菌呈负相关（P<0.05）。经logistic 回归分析研究发现，TLR4、IL-1、IL-18 是KOA 患者总菌的影响因素。可能的原因是KOA 患者肠道菌群失衡，肠道细菌发生异位，肠壁通透性增强，形成肠源性内毒素血症，导致TLR4 过表达，进而诱导膝关节软骨发生免疫应答，同时激活NFκB 途径促进软骨细胞中炎性因子IL-1、IL-18 的释放，引起膝关节慢性炎性病变。

本次研究发现膝关节炎患者TLR4、IL-1、IL-18 的异常表达，影响了患者的肠道菌群，在膝骨关节炎发病病程起一定的作用。对于KOA 的发病原因，肠内因素中具体是哪些肠道微生物及其代谢产物发挥了重要作用，肠外因素膝关节自身的疾病变化，还是两者互为影响，探索更多更精确的分子生物学机制，这将是需要下一步研究的内容。